А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 60

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 60)

Опытпроводился в присутствии нативныхS–S-связей. Черные кружки получены при разбавлении крепкого раствора GdmCl, в котором изначальнонаходился денатурированный белок,т. е. при ренатурации белка. При этом kapp≈ ku→N (так как здесь скорость разворачивания ku→N значительно превосходит скорость сворачивания kN→u).

светлые кружкиполучены при добавлении GdmCl к раствору изначально нативного белка, т. е.при его денатурации. При этом kapp≈ kN→u (так как при денатурации ku→N << kN→u).В самой нижней части шеврона ku→N kN→u ≈ kapp / 2. Обратите внимание на перекры≈≈вание черных и светлых кружков в этой области, в районе точки денатурации: онопоказывает, что здесь, действительно, белок сворачивается с той же скоростью,что и разворачивается. Пунктир показывает экстраполяцию величин ku→N и kN→uв области излома шеврона и за нее, сплошная линия — в области низких концентраций GdmCl. Отклоняющиеся от экстраполяционной прямой точки в верхнейлевой части графика (т.

е. вдали от точки излома, от точки денатурации белка)свидетельствуют либо о какой-то перестройке перехόдного состояния, либо о появлении каких-то дополнительных метастабильных интермедиатов (возможно,типа расплавленных глобул), которые могут лежать как на, так и вне основногопути сворачивания. Обратите внимание, что все эти перестройки и/ или интермедиаты не повышают скорость сворачивания по сравнению с той, что можно было быожидать при неизменности переходного состояния: отклоняющиеся точки, хотяи соответствуют наивысшей наблюдаемой скорости сворачивания, лежат ниже интерполяционной прямой.

картинка, с небольшими изменениями (добавлены экстраполяционные пунктиры) взята из T. Kiefhaber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)92:9029–9033285действительно, то что денатурант вообще разворачивает белок, показывает, что он сильнее притягивается к развернутому белку, чем к нативному. то, что денатурант замедляет сворачивание исходно развернутогобелка (см.

спад скорости в левой части рис. 20-4) показывает, что он сильнее притягивается к исходному, развернутому белку, чем к перехόдномусостоянию; а то, что денатурант ускоряет разворачивание исходно нативного белка (см. подъем скорости в правой части рис. 20-4), показывает,что он сильнее притягивается к перехόдному состоянию, чем к исходному,нативному.

Это означает, что контакт перехόдного состояния с денатурантом больше, чем у нативного белка, но меньше, чем у денатурированного.Иначе говоря, приведенный на рис. 20-4 шевронный график показывает,что перехόдное состояние по степени контакта с растворителем, т. е.по своей компактности, находится где-то на полпути между развернутым и нативным состояниями белка. Этот график дает даже больше: таккак наклон для k N→u несколько меньше, чем для ku→N, то компактностьперехόдного состояния несколько ближе (в данном случае) к оной у нативного белка, чем у денатурированного.рисунок 20-4 (как и рис.

20-2) относится к лизоциму — белку, денатурация которого гуанидингидрохлоридом приводит прямо к образованиюклубка, а не расплавленной глобулы. При умеренных концентрацияхденатуранта (при не очень сильном его разбавлении водой) лизоцимсворачивается довольно медленно, за многие минуты. Однако при самоорганизации в почти чистой воде (происходящей при сильном разведенииводой крепкого раствора гуанидингидрохлорида, где находились клубкообразные белковые цепи) скорость сворачивания лизоцима максимальна,и уже слабо зависит от остаточной концентрации денатуранта.

При этомв сворачивании лизоцима появляется компактный метастабильный интермедиат типа расплавленной глобулы, интермедиат, который не наблюдается при повышенных концентрациях денатуранта. таким образом, вдали от точки равновесия лизоцим демонстрируетдвухстадийное сворачивание, а вблизи — одностадийное. то есть нет физической разницы между «двух-» и «одностадийными» белками, если рассматривать их только вблизи точки равновесия.Однако изучать «одностадийные» белки проще: их переходное состояние в воде — то же, что и при всех других концентрациях денатуранта.Есть еще и техническое преимущество: длинные ветви шевронов прощеэкстраполировать. Поэтому именно изучение сворачивания «одностадийных» белков сыграло ведущую роль в исследовании перехόдных состояний.286 Появление компактных метастабильных интермедиатов сворачивания,вообще говоря, всегда «выполаживает» зависимость скорости сворачивания от содержания денатуранта — см.

левый край рис. 20-4, или дажеменяет знак ее наклона, так как шаг, лимитирующий скорость сворачивания, теперь начинается с более компактного состояния, чьи свойства(например, связанность с денатурантом) ближе к свойствам переходногосостояния, чем к свойствам бывшего начального состояния, развернутого. Известно, что ренатурация белка, стартующая не от клубка, а от расплавленной глобулы (например, ренатурация карбоксиангидразы), такжедемонстрирует довольно слабую зависимость скорости ренатурацииот концентрации денатуранта.

Последнее означает, что перехόдное состояние в таком сворачивании мало отличается от исходной расплавленнойглобулы по компактности.Иначе говоря, перехόдное состояние — по «промежуточности» некоторых своих свойств между свойствами нативного и развернутого белка — напоминает расплавленную глобулу. Напоминает по «средним»характеристикам, по энергии и компактности, но это еще не означает,что перехόдное (подчеркнем, нестабильное, в отличие от расплавленнойглобулы) состояние действительно похоже на расплавленную глобулу.Эксперимент (я расскажу о нем чере з минуту) показывает,что перехόдное состояние гораздо более неоднородно, чем расплавленнаяглобула.

Его (если речь идет о переходе «клубок → нативный белок») можно представить себе как кусок нативного белка, остальная часть котороговсе еще находится в денатурированном, клубкообразном состоянии. Видперехόдных состояний для переходов типа «расплавленная глобула → нативный белок» (и «клубок → расплавленная глобула») еще не установленэкспериментально, но весьма правдоподобно, что они также состоят из куска более структурированной фазы, в то время как остальная часть цепиостается в менее структурированной фазе. Природу перехόдного состояния удалось выяснить с помощью белковой инженерии. Применяя множество мутаций и анализируя соответствующие им изменения в шевронных графиках (см.

рис. 20-4, 20-5), удаетсяценой колоссального труда узнать, какие именно остатки вовлечены в «нативоподобную» часть перехόдного состояния (их мутации существенновлияют на скорость сворачивания), а какие — нет. Этот метод был разработан А. Ферштом в Англии.такой метод применим к любым переходам типа «все-или-ничего».Однако, строго говоря, пока что он применяется только к белкам, денатурация которых приводит прямо к образованию клубка, а не расплавленнойглобулы.287Рис. 20-5. схема, иллюстрирующая сдвиг «шевронного графика» при мутации.k — наблюдаемая скорость установления равновесия; C — концентрация денатуранта.

жирная линия — исходный белок (W. T.), тонкая — тот же белок с мутацией в одном остатке цепи (mut.). Пунктир показывает экстраполяцию величин ku→Nи kN→u в области излома шеврона. с0 — концентрация денатуранта, соответствующая середине денатурационного перехода в исходном (W. T.) белке (здесь разностьсвободных энергий нативной и денатурированной форм равна нулю — по определению «середины перехода»). На графике показаны измеряемые в этом опыте величины. Одна из них определяет влияние мутации на высоту свободно-энергетическогобарьера, стоящего на пути из развернутого состояния в нативное: ∆ (F# – Fu) == –RT∆lnku→N.

Вторая — ее влияние на стабильность белка, т. е. на разность свободных энергий нативного и денатурированного состояний: ∆ (FN — Fu) = –RT∆ln[ku→N / kN→u]. Их отношение ∆(F# – Fu) / ∆(FN – Fu) называется величиной Фf для мутированного остатка. В данном случае Фf ≈ 1 / 4, т. е. остаток, мутация которогорассматривается, как бы на четверть вовлечен в ядро сворачивания. Показанныена графике величины относятся к концентрации денатуранта C0, где требующаясяэкстраполяция минимальна (а потому минимальны и погрешности в ней).

Однако,ценой несколько большей экстраполяции (до C = 0), так же обычно определяются изменения в стабильности нативного белка ∆(FN – Fu) и в высоте барьера∆(F# – Fu), а также величины Фf, относящиеся к чистой воде для оценки вовлеченности остатка в нативоподобную часть переходного состояния (как говорят, в «зародыш», или в «ядро сворачивания»белка), оценивают, по сдвигу шеврона, влияние мутации данного остаткана (а) скорость сворачивания белка и (б) на стабильность нативной формыбелка. Мутируя остаток с целью изучения ядра сворачивания, его обычноменяют на более мелкий (как правило, на аланин или, реже, глицин) с тем,чтобы структура мутантного белка не искажалась бы слишком сильно.

Измеряемые величины показаны на рис. 20-5.стабильность нативной структуры белка N относительно его развернутого состояния U (при заданном состоянии среды, например, заданнойконцентрации денатуранта) определяется величиной FN –Fu, разностьюсвободных энергий этих двух состояний белковой молекулы (измереннойпри тех же условиях). А FN – Fu определяется (см. формулу (20.4)) соотношением между скоростью сворачивания и скоростью разворачивания288белка при заданном состоянии среды.

Характеристики

Список файлов лекций