А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 58
Текст из файла (страница 58)
8.132. 1 1я 1ОО зо 60 7О во 60 40 зо 20 1О о 200 260 270 260 260 гзо гго г10 240 91 /г Рис. 8.132 310 Глава 8. Основные направленна фрагментации органических соединений 8.15. Аминокислоты, пептиды, белки С тех пор как в 1958 г. Клаус Бимаи 1425] впервые получил спектры аминокислот, масс-спектрометрия шагнула далеко вперед. Основной задачей Бимаиа было ввести полярные термолабильиые молекулы в ионный источник и провести их иоиизацию. В последующие двадцать лет с появлением химической иоиизации, полевой десорбции и полевой иоиизации удалось добиться определенных успехов в анализе простых пептидов, однако эксперименты были трудоемки, характеризовались плохой воспроизводимостью и требовали проведения химической дериватизации исходных соединений для 1ОО 1 И во во 2О во во 40 зо 20 1О о зо 40 ВО 00 ГО 00 00 100 110 120 Е1 /2 1ОО во во го во во 40 зо 20 10 о 2О во во 100 120 140 100 40 01 /2 100 во во то во во 4О зо 20 1О а 1ВО 140 12О 1ОО во во 20 01 /2 Рис.
8ДЗЗ. Масс-спектры ЭУ аминокислот аспарагина (а), фенилалаиина (6) и метионина в) 8.! 5. Аминокислоты, пептикы, белки 311 1ОО ао во 7О во ЗО ЯО ЗО 20 1О О 10 20 ЗО 40 50 50 70 ВО 50 100 110 120 1ЗО 140 150 1ОО ОО во 70 во 50 ЯО ЗО гО 10 О ЗО 40 50 бО 70 50 ВО 100 110 120 1ЗО 140 150 1бО 170 150 Рнс. 8.134. Масс-спектры электронного удара метилового эфира лейцина (а) и 1т'-ацетилизо- лейцина(б) повышения их летучести. Достижения масс-спектрометрии в этой области с 1958 до 1978 г.
изложены в исчерпывающей монографии Б. В. Розынова [20]. Хотя ст-аминокислоты, являющиеся «кирпичиками» белков, можно изобразить общей формулой КХН вЂ” СНК вЂ” СООН, разнообразие структур боковых групп (К) приводит к высокой индивидуальности их спектров (рис. 8.133). Среди общих направлений можно выделить аминный распад (элиминирование боковой группы К и карбоксильной группы). Сохранение заряда на К (ионы К+) характерно для ароматических аминокислот (тирозин, триптофан, фенилаланин). В частности, в спектре последнего (рис.
8.133,б — пик иона РЬСН+ с в/2 91)— второй по интенсивности в спектре. При достаточной длине цепи К возможна перегруппировка Мак-Лафферти (треонин). Для увеличения летучести соединений использовали их дериватизацию. Наиболее распространенными вариантами являются алкилирование и ацилирование.
На рисунке 8.134 представлены масс- спектры электронного удара Х-ацетилизолейцина и метилового эфира лейцина. Спектры химической ионизации аминокислот столь же индивидуальны. Пики протонированных молекулярных ионов аминокислот имеют достаточно высокую интенсивность [426], особенно при использовании в качестве газа-реагента изобутана [427]. Фрагментация, как обычно в условиях химической ионизации, незначительна и существенно зависит от структуры аминокислоты, причем отмечается, что фрагментация резко возрастает при увеличении температуры источника [427]. 312 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений В спектрах химической ионизации отрицательных ионов при использовании в качестве иона-реагента ОН 1428] доминируют пики депротонированных молекулярных ионов 1М вЂ” Н] .
При использовании С1 помимо этих ионов образуются также ионы 1М+СЦ, однако их пики исчезают из спектров аминокислот, содержащих дополнительные полярные группы 1429]. Возможности электронного удара н химической ионизации резко уменьшаются при переходе к петидам в связи с еще меньшей летучестью и повышенной термолабильностью этих соединений. Для анализа простейших пептидов этими методами используются различные виды дериватизации, включая алкилирование, ацилирование, триметилсилилирование и т.
д. 120]. Тем не менее по этим спектрам уже можно было устанавливать последовательность аминокислотных звеньев 120, 430, 431]. Однако реальный прорыв в масс-спектрометрии пептидов связан с появлением метода бомбардировки быстрыми атомами (разд. 5.10). Благодаря ему стало возможно достаточно легко устанавливать молекулярные массы и последовательность аминокислотных звеньев олигопептидов с массами в несколько тысяч дальтон. Еще больших успехов удалось добиться с помощью методов электрораспыления (разд.
5.12) и матричной лазерной десорбционной ионизации (разя. 5.14), которые позволили анализировать сложнейшие белковые молекулы и сделали масс-спектрометрию ключевым методом новой науки — протеомики. Именно эти три метода (ББА, МЛДИ и электроспрей) используются в настоящее время для анализа пептидов и белков. Рассмотрим плюсы и минусы этих трех методов применительно к анализу пептидов и белков.
Бомбардировка быстрыми атомами исторически была первым эффективным методом для установления последовательности аминокислотных звеньев в недериватизованных пептидах 1432, 433]. ББА позволяет устанавливать массы молекулярного и фрагментных ионов с большой точностью. Кроме того, время анализа невелико. Однако поскольку диапазон регистрируемых масс обычно не превышает ЗОООДа, а для анализа необходимо иметь не менее 100 пикомолей чистого образца, ББА может применяться только для анализа олигопептидов.
яа-Нитробензиловый спирт оказался наилучшей матрицей для этой цели. В качестве растворителя образца используют смесь воды и ацетонитрила с возможными добавками метанола, уксусной и трифторуксусной кислот. ББА не является мягким методом. Поэтому обычный спектр характеризуется значимой фрагментацией молекулярного иона.
Тем не менее для целей определения последовательности аминокислотных звеньев в пептиде лучше использовать тандемную масс-спектрометрию (гл. 7). МЛДИ обладает высокой чувствительностью (уровень аттомолей, 10 'в М), не требует сложной пробоподготовки и позволяет работать с гетерогенными образцами. Метод позволяет установить молекулярную массу пептида или белка в сотни тысяч дальтон с точностью 0,5 — 0,01е4. Для него характерны протонированные молекулярные ионы МНч и адлукты с катионами щелочных 8.15. Аминокислоты, пептилы, белки 313 металлов 1М+На]+ и [М+К]+.
В качестве матриц наиболее часто используют 2,5-дигидроксибензойную и и-пиано-4-гидроксикоричную кислоты. Первая особенно успешно применяется для легких соединений с молекулярной массой до 1000 Да, поскольку характеризуется незначительными фоновыми пиками в области низких масс. Отмывание пробы, уже нанесенной на матрицу, от примесей солей и ПАВ приводит к улучшению качества спектра, ио приемлемого результата можно достигнуть и с неочищенной пробой.
К недостаткам метода можно отнести тот факт, что некоторые компоненты неочищенных смесей могут давать очень интенсивные пики в спектрах. Эти пики могут маскировать наличие действительно важных для исследователя компонентов, т. е. МЛДИ не является методом количественного анализа. Электрораспыление в режиме ЖХ-МС (разд. 1.5 и 5.12) благодаря высокой точности, возможности стыковки с квадрупольными анализаторами и образованию многозарядных ионов позволяет устанавливать молекулярные массы тяжелых пептидов и белков (в миллионы дальтон 17]), работать со смесями соединений, надежно устанавливать последовательность аминокислотных звеньев в условиях МС/МС.
Практические наблюдения показывают, что для злектроспрея характерно присоединение одного протона на участок цепи аминокислот массой в 1000 Да. Таким образом, белок с молекулярной массой 100 кДа можно зарегистрировать на шкале масс в области >пзбг = 1000. К недостаткам метода можно отнести требование высокой гомогенности пробы и отсутствия значимых уровней солей (менее 1 ммоль). Одним из наиболее популярных применений масс-спектрометрии для анализа пептидов является определение последовательности аминокислотных звеньев (первичная структура белка).
Этот подход стал рутинным для пептидов с молекулярной массой до 2500 Да. Нельзя сказать, что масс-спектрометрия полностью вытеснила классические биохимические методы типа здмановского разложения. Однако возможности масс-спектрометрического подхода шире. В частности, чувствительность эдмановского разложения невысока, пептиды перед секвенированием должны быть хорошо очищены от примесей, а реагент Эдмана не взаимодействует с модифицированными по терминальной аминогруппе пептидами.
Кроме того, поскольку эдмановское расщепление основано на последовательном разрыве амидных связей с Н-конца пептида с хроматографическим определением образующихся аминокислот, любые посттрансляционные модификации исходного пептида приведуг к образованию нестандартных молекул. Для их идентификации необходимо иметь богатейшую библиотеку стандартов всех возможных модификаций аминокислот. Вопрос о месте присоединения и структуре модифицирующей группы, напротив, легко может быть решен массспектрометрически.
Наилучших результатов можно добиться при использовании комплекса методов. Например, здмановское или энзиматическое расщепление белка или тяжелого пептида на более мелкие фрагменты с последующим их 314 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений масс-спектрометрическим анализом, несомненно, будет наиболее эффективным подходом [4341. Молекулярная масса белка является его ключевой физико-химической характеристикой. Она отражает его аминокислотный состав и наличие модифицирующих заместителей.
Измерение массы позволяет выявить также чистоту и гомогенность образца. Определение молекулярной массы пептидов не представляет сложности. Для «легких» представителей этого класса (молекулярная масса 1-8 кДа) можно использовать все три указанные выше метода (ББА, МЛДИ, электрораспыление). Для полипептидов и белков с большими молекулярными массами бомбардировка быстрыми атомами неприменима, но два другие метода отлично справляются с задачей.
МЛДИ с времяпролетным анализатором позволяет получить непосредственно протонированный молекулярный ион соединения с массой в сотни килодальтон. Максимальная точность метода 0,01;4 может быть достигнута при правильном выборе внутреннего стандарта. Спектр, полученный методом электрораспыления, характеризуется набором многозарядных протонированных молекулярных ионов. В разд. 5.12 подробно описан метод расчета молекулярной массы соединения по такому спектру.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
