А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Для олигомера с 20 основаниями необходимо выбирать уже из трех изобарных ионов с каждой целочисленной массой [487]. Как и в случае белков, секвенирование нуклеиновых кислот позволяет не только определить последовательность нуклеотидов, но и сделать вывод о мутациях, других изменениях молекул [488]. Для установления последовательности 328 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений нуклеотидов в нуклеиновой кислоте с помощью активации соударением вновь необходимо использовать максимальную разрешающую способность и точность измерения масс, для того чтобы избежать неоднозначности в отнесении состава фрагментов.
Тем не менее спектры получаются очень сложными и требуют значительного времени для интерпретации. В качестве примеров конкретных исследований можно привести работы [475, 48б, 489-49Ц. В связи со сложностью интерпретации спектров тандемной масс-спектрометрии для установления сиквенса активно используется леддерная техника, аналогичная описанной для белков (разд. 8.15). Процесс включает последовательное энзиматическое отщепление нуклеотидов от одного или другого конца цепи с измерением разницы в массе.
В данном случае требования к разрешающей способности менее строги, хотя остаются достаточно жесткими [492, 4931. Наиболее простым методом секвенирования является процесс Зангера с массспектрометрическим окончанием. Замена классической гель-хроматографии на масс-спектрометрию привела к значительному сокращению времени анализа. В этом случае требования к разрешающей способности прибора минимальны, поскольку характеристические пики отстоят друг от друга примерно на 300 Да [494, 495]. 8.17. Масс-сиектрометрический анализ микроорганизмов Проблема идентификации микроорганизмов возникла, как только стала понятна взаимосвязь бактерий с заболеваниями. В классическом варианте идентификацию гомогенных образцов микроорганизмов, полученных культивированием в лабораторных условиях, проводили с помощью микроскопа.
Современные методы идентификации (включая автоматы для характеристики микроорганизмов по набору энзиматических реакций со спектральным детектированием), хемотаксономическая характеристика (основанная на анализе жирных кислот с помощью газовой хроматографии), а также характеристика генов не лишены недостатков. Такие анализы занимают много времени, а для их проведения необходимы чистые виды (штаммы). Работа со смесями микроорганизмов значительно менее эффективна и может привести к ложным результатам. Масс-спектрометрия оказалась отличным методом для анализа биологических образцов и позволяет преодолеть указанные затруднения. Современный прибор дает возможность анализировать молекулы с молекулярной массой выше 10 Да, в том числе в неразделенных и неочищенных смесях (клеточные лизаты, смеси пептидов и белков после различных расщеплений и т.
д. [496, 497)), Для проведения анализа требуются считанные минуты и фемто-аттомоли (10 10 'а) вещества. В частности, образец для детектирования маркеров широкого 8.17. Масс-снекгрометрический анализ микроорганизмов 329 круга микроорганизмов в смешанных популяциях может быть проанализирован в течение нескольких минут. Можно выделить три типа масс-спектрометрического анализа микроорганизмов. Наиболее примитивный подразумевает быстрый скрининг для установления присутствия бактерий, вирусов, грибов, других микроорганизмов в воде, воздухе, продуктах и т.
д. Второй тип анализа включает идентификацию микроорганизмов, иногда на уровне вида или штамма. Для этой цели массспектрометрия, как правило, используется в комбинации с другими методами, а для подготовки образца проводят лабораторное культивирование. Благодаря обобщению накопленных в этой области данных и переходу к созданию соответствующих библиотек масс-спектрометрия позволяет в кратчайшие сроки эффективно идентифицировать смесевые препараты. Третий, наиболее трудоемкий уровень исследований подразумевает установление состава и структуры отдельных молекул в конкретных микроорганизмах.
Масс-спектрометрия была впервые применена для анализа микроорганизмов по типу «отпечатков пальцев» в 70-х годах прошлого века. Использовали пиролитическую масс-спектрометрию (разд. 5.15) с детектированием низкомолекулярных (молекулярные массы ниже 150 Да) продуктов разложения или контролируемый нагрев обезвоженных бактерий с регистрацией соединений с молекулярными массами до 700 Да [498). С внедрением в практику массспектрометрии бомбардировки быстрыми атомами, методов лазерной десорбции, электрораспыления, а также использование тандемной масс-спектрометрии позволило проводить анализ смесей нелетучих органических соединений с большими молекулярными массами.
В результате появилась возможность идентифицировать биомаркеры конкретных групп и индивидуальных микроорганизмов. В качестве таких маркеров используются углеводы, гликолипиды, фосфолипиды, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты и т. д. [8, 499-50Ц. Самый ценный бномаркер, безусловно, представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые являются наиболее индивидуальным и полным признаком объекта. Масс-спектрометрическое секвенирование генов пока не дает столь эффективных результатов, как секвенирование пептидов и белков (разд. 8.15 и 8.16), однако измерение молекулярных масс продуктов расщепления генов позволяет получать достоверную информацию о составе исходной молекулы.
Сравнение результатов с базами данных дает возможность распознавать отдельные виды даже в смешанных популяциях. К сожалению, каждая клетка содержит лишь одну молекулу ДНК, а количество молекул РНК не превышает 0,01;4 сухой массы бактерий и 1;4 сухой массы спор. Хорошими биомаркерами являются белки. Большинство белков микроорганизмов имеют молекулярные массы в диапазоне 4000-15000 Да [502].
Они составляют более 50'Ы сухой массы микроорганизмов. С их помощью можно различать очень близкие друг другу виды, а также подвиды, штаммы и их споры [5031. Например, метод МЛДИ позволяет получить информацию о молекулярной 330 Глава 8, Основные направлении фрагментации органических соединений массе белка, а также молекулярных массах продуктов их энзиматического расщепления. Уже по набору этих продуктов можно делать важные выводы о принадлежности образца к тому или иному виду микроорганизмов. Для экспрессного установления последовательности аминокислот в структуре пептидов, полученных в результате расщепления белков, применяют тандемную массспектрометрию.
Технически МЛДИ-анализ белков микроорганизмов мало отличается от обычного анализа белков. Важнейшим различием является дополнительная процедура по разрушению оболочки клеток. Однако эта стадия легко осуществима при добавлении к образцу кислот [503), метанола [5041 или этанола [505], причем метанол стабилизирует образец лучше, чем, например, трифторуксусная кислота [5061. Кроме того, следует подчеркнуть, что, поскольку подавляющее большинство матриц МЛДИ является органическими кислотами, контакт микроорганизмов с матрицей часто приводит к разрушению оболочек клеток без каких-либо дополнительных стадий.
Расшифровка генома микроорганизма значительно облегчает и увеличивает надежность белкового анализа. Например, многие пики в спектре МЛДИ Яасгйаготусез сегЬалае хорошо коррелировали с молекулярными массами белков, предсказанных на основе генома данного микроорганизма [5071. Этот подход активно используется и в других исследованиях [508, 5091. Повышенная надежность такого варианта объясняется тем, что в зависимости от типа пробоподготовки и состояния анализируемого микроорганизма набор детектируемых белков может быть различным.
Однако все эти белки могут быть легко связаны с ДНК организма. Тем самым надежность идентификации организма возрастает. Очень широко используется в анализе белков компьютерный поиск по базам данных, включая Интернет. Один из рабочих адресов— тчицн.ехразу.спг1оо!з/рер1Ыеп1.Ыш1. В этих базах собраны данные о сотнях тысяч белков, поэтому информация о молекулярной массе пептида или белка и о начальной последовательности аминокислотных звеньев (метка сиквенса) дает возможность вести эффективный компьютерный поиск.
При масс-спектрометрическом изучении целых (интактных) микроорганизмов и нх спор полезную информацию предоставляют полярные липиды. В этом случае готовят суспензию клеток микроорганизма в растворителе или наносят их на твердую подложку, например матрицу МЛДИ. За счет взаимодействия со средой в этих условиях идет лизирование большинства бактериальных клеток. Хотя состав жирных кислот может изменяться в жизненном цикле организма, полярные головные группы фосфолипидов достаточно стабильны, чтобы использовать их для таксономической характеристики. Полярные липиды составляют около 5-Зсс сухой массы бактерий, их легко выделять и анализировать, например, с помощью бомбардировки быстрыми атомами.
В связи с этим полярные липиды оказались наиболее удобным классом органических соединений, анализ которых позволяет проводить идентификацию микроорганизмов. 8.17. Масс-спекгрометрический анализ микроорганизмов 331 В частности, для грамотрицательных бактерий характерен фосфатидилэтаноламин, для грамположительных бактерий — фосфатидилглицерин, для грибов— фосфатидилинозитол, для инкапсулированных вирусов — фосфатидилхолин, для микроводорослей — сульфонолипиды. Для регистрации этих характеристических головных групп полярных липидов используют тандемную масс-спектрометрию.
Выделяя молекулярный ион, проводя его активацию соударением и регистрируя спектры дочерних ионов или спектры выбросов идентичных нейтральных частиц, можно детектировать характеристическую группу и отнести образец к тому или иному классу микроорганизмов. Масс-спектрометрическое исследование вирусов включает не только идентификацию вирусов, но н изучение связывания вирус — антитело, взаимодействия белок — белок и динамических изменений белков [510]. Использование злекгрораспыления дает возможность измерять молекулярные массы ДНК интактных вирусов [7, 511].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
