А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Интереснейшим фактом является то„что вирус может не погибнуть во время анализа. В частности, Сьюздаку [510] удалось инфицировать листья табака вирусом табачной мозаики, подвергнутым предварительному массспектрометрическому анализу. Анализ белков капсид вирусов [512, 513] становится рутиной, поскольку молекулярные массы этих соединений редко превышают 10000 Да. В условиях МЛДИ при взаимодействии с кислой матрицей происходит денатурация белков, так что для установления первичной структуры необходимо лишь смешать солюбилизированный образец с материалом матрицы и провести анализ. Массспектрометрическая идентификация вирусов по белкам их капсид достаточно проста, поскольку последовательность аминокислот в вирусном пептиде и последовательность нуклеотидов в ДНК уже известны для большинства вирусов.
Поэтому идентификации по величинам овгз продуктов энзиматического расщепления является скорее компьютерной процедурой и легко осущестапяется в автоматическом режиме с использованием баз данных. В последнее время возрастает важность экспрессной идентификации патогенных микроорганизмов как части контртеррористических мероприятий. На 50-й конференции Масс-спектрометрического общества США в Орландо в июне 2002 г. этим вопросам была посвящена работа отдельной секции. Действительно, масс-спектрометрия может быть крайне эффективной при достижении этих целей.
Получают спектр типа «отпечатков пальцев» и сравнивают его со спектрами соответствующей библиотеки масс-спектров микроорганизмов, которые потенциально могут быть использованы в качестве биологического оружия (514]. Для анализа атмосферы можно использовать прямой забор проб воздуха [515] или депонирование частиц из воздуха на полимерный материал [516]. Для определения микроорганизмов в воде [517, 518] хорошо зарекомендовали себя специально подготовленные поверхности (аналог поверхностной матричной лазерной десорбционной ионизации, разд.
5.14). Глава 9 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ С момента своего возникновения масс-спектрометрия была признана методом количественного анализа. Для грубой количественной оценки можно использовать площадь под кривой полного ионного тока, полученной при полном испарении образца из штока прямого ввода. Важно только, чтобы кривая испарения вещества не перекрывалась кривой испарения другого компонента образца. Однако даже в последнем случае можно провести измерения, если использовать для расчетов площади под кривой не всего ионного тока, а тока характеристических для каждого из юмпонентов смеси ионов (разд. 9.1).
На рисунке 9.1 представлена кривая полного ионного тока, полученная при полном испарении образца, состоящего из двух компонентов. В данном случае можно говорить о термограмме образца. Компоненты образца существенно отличаются по температуре испарения, поэтому плавный нагрев пробы позволяет получить индивидуальные пики обоих ингредиентов. Масс-спектры компонентов приведены на рис. 9.1,б и в. Спектры не перекрываются и позволяют надежно идентифицировать соединения, а площади под кривыми на термограмме дают возможность провести количественную оценку состава смеси. Если необходимо измерить абсолютное количество конкретного соединения в препарате, оптимальным вариантом является предварительное построение калибровочной кривой, связывающей количество анализируемого соединения в граммах и площадь под кривой полного ионного тока или тока характеристического иона.
Однако прямой ввод может более или менее эффекгивно использоваться только для анализа простых смесей. Наилучшим инструментом для проведения юличественного анализа смесей органических соединений является хроматомасс-спектрометрия. В этом случае на входе мы имеем неизвестную смесь органических соединений, а на выходе— полную информацию о ее качественном и количественном составе.
Масс-спектр позволяет идентифицировать соединение, а площадь хроматографического пика — оценить количество этого соединения в пробе. На рисунке 9.2 представлена хроматограмма по полному ионному току смеси 46 приоритетных загрязняющих веществ. Все пики разрешены у нулевой линии, их площади могут быть легко и точно проинтегрированы. Проблемы возникают при анализе сложных многокомпонентных систем, например природных соединений. На рисунке 9.3 представлена хроматограмма по полному ионному току дихлорметанового экстракта цветов тысячелистника.
Глава 9. Количественный масс-спектрометрический анализ 333 а о<с е ае ° к л а ее<в ю е:м еюм .о Рис. 9Л. Кривая полного ионного тока двухкомпонентного образца (а), испаряемого из штока прямого ввода, и масс-спектры компонентов (б и в) зщмнин Рнс. 9.2. Хроматограмма приоритетных органических загрязняющих веществ, экстрагируемых из нейтраль- ной и щелочной среды (метод 625 Агентства по охране окружающей среды США (458]) т!С: т.зоязз.о ьн м ~.е от ям от иоооооо т> .оо иа.оо зв.оо Рнс.9.3.
Хроматограмма по полному ионному току дихлорметанового экстракта фракции биологически активных соединений цветов тысячелистника 9л. масс-хроматография 335 На этой хроматограмме более половины пиков недостаточно разрешены, а часть пиков обусловлена двумя и более компонентами с близкими временами выхода. В таком варианте прямое интегрирование площади пика приведет к неправильным результатам. Для проведения количественного хроматомасс-спектрометрического анализа смесей органических соединений используют две родственные техники: масс- хроматографию и масс-фрагментографию.
9.1. Масс-хроматография Метод масс-хроматографии не связан ни с каким особым проведением эксперимента. Ведется обычный хроматомасс-спектрометрический анализ с полным сканированием масс-спектра в заданном диапазоне масс. Качественное определение ингредиентов осуществляется по их масс-спектрам и временам выхода.
Однако для количественного определения компьютер строит хроматограммы по току характеристических для каждого соединения ионов. Внешний вид хроматограммы может полностью измениться по сравнению с исходной хроматограммой, построенной по полному ионному току, поскольку все ионы, за исключением заданных„игнорируются. На рисунке 9.4 представлена хроматограмма по полному ионному току дихлорметанового экстракта тюленьего жира и масс-хроматограммы по току ионов с а/з 326, 360 и 394, характерных для пентахлор-, гексахлор- и гептахлорбифенилов соответственно.
Все пики на полученных масс-хроматограммах хорошо разрешены, а их площади могут быть легко вычислены интегрированием. Следует обратить внимание, что ни один из этих пиков не может быть надежно зарегистрирован на хроматограмме по полному ионному току. Этот факт тем более интересен, что речь не идет об увеличении чувствительности метода. Фактически, меняется только форма представления результатов. Такая форма характеризуется повышенной селективностью. Масс-хроматография позволяет во многих случаях проводить качественный и количественный анализ компонентов, которые не разделяются хроматографически. Если есть подозрение о наложении масс-спектров двух соединений с близкими временами выхода, имеет смысл построить масс-хроматограммы по ионам, характеризующимся наиболее интенсивными пиками.
Как правило, компоненты выходят не абсолютно одновременно. Пик на хроматограмме по полному ионному току оказывается уширенным (рис. 9.5,а), но на масс-хроматограммах отчетливо видно, что вершины пиков характеристических ионов, принадлежащих двум компонентам, сдвинуты друг относительно друга (рис. 9.5, в). Проведя вычитание масс-спектра, записанного на вершине второго пика, из масс-спектра, записанного на вершине первого, можно получить индивидуальный спектр первого компонента.
Вычитание масс-спектра первого пика из масс- 336 Глава 9. Количественный масс-спектрометрический анализ Т(О: МЕПРА1.0 АЬнповпов 1 ВООООО 1 200000 тв1 в— О 1 В.ОО 1 О.ОО (оп 325.00 (326.70 (о 326.70): ЙЕПРА1.0 АЬнпаапса 10ООО Т(тв— 24.00 24.60 26.00 2Б.БО 29.00 26.БО 27.00 27.60 2В.ОО 2В.БО 29.00 )ОП ЗВО.ОО (369.70 (О 350.70); ЙЕПРА1.О АЬППОапов 1 ОООО тьп -Р 24.00 24.50 25.00 26.60 25.00 25.60 27.00 27.60 2В.ОО 2В.БО 29.00 (ап 394.00 (393.70(о 394.70): ПЕйРА1.0 АЬнпаапов твпв- 24.00 24.60 2Б.ОО 26.60 26.00 26.60 27.00 27.60 2В.ОО 2В.БО 29.00 Рис. 9.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
