А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Гндроксильная группа С-конца превращена в амидную. Над спектром обозначена последовательность аминокислотных звеньев со стороны С-конца (серня Ь), а под спектром — со стороны Х-конца (серия у). Ион соответствующей серии может отсутствовать в спектре. В этих случаях нельзя точно установить порядок пары (ЬО или ОЬ) аминокислотных звеньев. Поскольку серии у и Ь дополняют друг друга, иногда можно установить точную последовательность по одной из серии.
Например, в серии у последовательность аминокислот внутри участка РА1 не определяется. Однако это легко сделать по серии Ь. Как уже отмечалось выше, в случае тяжелых пептидов и белков процесс определения последовательности аминокислотных звеньев проводится не с самой молекулой, а с ее более мелкими фрагментами, которые получают путем химического или энзиматического расщепления исходной молекулы. 320 Глава 8. Основные направленнл фрагментации органических соединений Леддерное секвенирование является еще одним способом установления последовательности аминокислотных звеньев в пептидах и белках.
В этом случае проводят контролируемое статистическое расщепление пептидных связей химическими методами (например, эдмановское расщепление), причем каждый последующий фрагмент отличается от предыдущего на одну аминокислоту. Последующий МЛДИ-анализ полученной смеси (леддер секвенированного белка) позволяет идентифицировать аминокислоты по разности масс между соседними пиками в масс-спектре и таким образом устанавливать их последовательность в исходной молекуле белка.
Это достаточно быстрый и эффективный метод, все активнее применяющийся в биохимических и масс-спектрометрических лабораториях. К недостаткам этого метода можно отнести требование высокой чистоты анализируемого пептида, а также высокий химический фон, образуемый непрореагировавшими реагентами и побочными продуктами. Задача 8.111. По спектру активации соударением МН+ пептида (рис. 8.139) установите последовательность аминокислот по пикам ионов серий у и Ь.
Принимайте во внимании только маркированные пики. Концевая гидроксильная группа заменена на аминную. (н) (Мщч) 7737 7Л/Х (У+2) (У+2) Рис. 8.139. Масс-спектр активации соударением МН+олигопептида 8.15. Аминокислоты, пептиды, белки 321 Задача 8.112. Определите последовательность аминокислотных звеньев в масс-спектре активации соударением МН+ олигопептида, представленном на рис. 8.140.
Принимайте во внимании только маркированные пики. Концевая гидроксильная группа заменена на аминную. (В) (МН') 2669 (В) ПЛ'2 (У+2) Рис. 8.140. Масс-спектр активации соударением Мн+олигопептида 8.152.Пептиднаи карта масс Картирование пептидов — обычная процедура анализа смеси продуктов протеолитического расщепления белка. Наряду с масс-спектрометрическим картированием хорошо известны хроматографические и электрофоретические методы. Часто последовательность аминокислотных звеньев анализируемого белка известна заранее. Использование конкретных ферментов позволяет расщепить исходную молекулу на соответствующие фрагменты, молекулярные массы которых можно вновь рассчитать заранее. Различие в массах между расчетом и экспериментом означает, что данный фрагмент исходной молекулы модифицирован.
Пептидная карта масс позволяет проверить правильность сиквенса, установить конформационные изменения в результате связывания лигандов, выявить посттрансляционные модификации (природу заместителей и места связывания), а также закрытые участки в структуре белка. Сравнение карт белков, и †322 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений сиквенс которых незначительно различается, дает возможность изучать мутации и посттрансляционные модификации.
Использование метода ЖХ-МС превносит в картирование пептидов дополнительное измерение — время удерживания. Итак, пептцдная карта является «отпечатками пальцев» конкретного белка. Работа над составлением пептидных карт немыслима без компьютерного обеспечения. Учитывая важность правильной интерпретации результатов, получаемых ежедневно в лабораториях всего мира, первостепенное значение имеет доступность программного обеспечения. В данном случае можно говорить о наиболее тесном и эффективном сотрудничестве ученых в этой области.
Программы для проведения и обработки результатов картирования пептидов [439-445], а также конкретные результаты доступны, например на сайтах йсср: //вплвг. вапп. елйэ1-ЬеЫе1Ьещ. с)е и влет». ехраву. сЬ/ тоо1в/рерт.йбепт..Ьтдв1. Программы по анализу сиквенса белков входят в общий пакет программного обеспечения основных приборопроизводительных фирм. Эти программы, используя данные сиквенса белка в качестве основы, позволяют рассчитывать молекулярные массы конкретных пептидных фрагментов (например, после обработки данного белка трипсином). Сравнение полученных результатов с расчетами дает возможность делать надежные выводы о составе и структуре белка.
Фактически один из основных путей идентификации белка включает его расщепление трипсином, масс-спектрометрический анализ смеси продуктов, поиск по базам данных сиквенса белков всех теоретически возможных пептидов (продуктов расщепления) для всех известных белков и, наконец, выбор наиболее вероятного соединения, пептидная карта масс которого наиболее близка полученной в эксперименте. Метод проверки установленного сиквенса включает компьютерную программу (БЕЯПЕЯТ), реконструирующую модельный тандемный масс-спектр, который далее сравнивается с реальным масс-спектром с помощью корреляционных функций [445].
Широкое использование баз данных и программного обеспечения привело к созданию метода [44б], названного молекулярным дроблением (апогйпп). Поскольку тандемная масс-спектрометрия дает возможность проводить анализ смесей, протеолитическому разложению подвергается смесь белков. Полученная сложная смесь пептидов анализируется масс-спектрометрически, а результаты автоматически обрабатываются компьютером. Устранение процесса выделения и очистки приводит не только к резкому сокращению времени анализа, но и исключает возможные химические изменения структур белков во время этих процедур. Метод молекулярного дробления особенно эффективен, если геном организма полностью расшифрован. Работа с базами данных становится более эффективной при наличии «меток сиквенса» [447]. Этот термин означает, что известна начальная последовательность аминокнслотных звеньев (две — три аминокислоты) с любого конца пептида и его масса. Если такая метка позволяет подобрать хорошего кандидата в пептидной базе данных, двойная масс-спектрометрия может быть использована только для подтверждения выбора.
Этим методом можно анализировать и мо- 8.15. Аминокислоты, пептиды, белки 323 дифицированные пептиды. Такой подход значительно сокращает время анализа белке, поскольку расшифровка спектров тандемной масс-спектрометрии, часто требующая длительного времени, в большинстве случаев опускается. Если необходимо проанализировать модифицированный белок, последовательность действий отличается незначительно. Сначала определяют молекулярную массу исходного белка.
Далее составляют пептидную карту, чтобы обнаружить модифицированные пептиды. Затем ферментативно или химически удаляют модифицирующие группы. Завершается процесс сравнительным массспектрометрическим анализом модифицированных и нормальных пептидов. Метод пептидной карты масс используется также для межвидовой идентификации. В этом случае базы данных по белкам одного организма используются для идентификации менее изученного организма [448]. В основе этого подхода лежит правило: если организмы обладают аналогичными белками, места протеолитического расщепления белка на олигопептиды также будут аналогичны.
8.15.3. Протеомика Обсуждая масс-спектрометрию белков, нельзя не остановиться на протеомике. Этой области знаний посвящена добрая половина современных масс-спектрометрических исследований и монографий [160, 449-458). Последним достижениям в этой области посвящен также один из последних номеров журнала массспектрометрического общества США [4591. Протеомика занимается изучением протеома, связанного с геном конкретного организма. Термины протеомика и протеом были введены в мировую практику Марком Уилкинсоном в начале 90-х годов ХХ века.
В определенной степени эти термины навеяны аналогией с геномикой и геномом. Целью протеомики является установление составов, структур, модификации и назначения всех белков, производимых геномом организма. В отличие от привычной белковой химии протеомика изучает мульти- белковые системы как часть всего организма. Работа ведется со смесями белков, идентификация которых осуществляется благодаря частичному секвенированию и широкому использованию баз данных.
Это скорее системная, а не структурная биология. Поэтому задача протеомики — охарактеризовать поведение системы в целом, а не ее отдельных компонентов. Хотя, расшифровав геном, можно знать а рпоИ, какие белки может произвести данный организм, протеомика развивается столь же быстро, что и геномика. Расшифровка генома и даже знание количеств конкретных РНК в клетке не дают надежной информации о количестве конкретных белков в клетке. Белки различаются по устойчивости, реакционной способности и функциям; часть из них может быть вовлечена в разнообразные быстрые и медленные клеточные циклы.
Эндогенные постгрансляционные модификации, мутации и другие изменения под действием веществ из окружающей среды дополнительно изменяют структуру и свойства исходных белков. 324 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений Протеомика базируется на четырех методах. Масс-спектрометрня является одним из них и используется, как уже было отмечено выше, для установления молекулярных масс белков и пептидов (продуктов расщепления белков), для установления последовательности аминокислотных звеньев в пептидах, а также природы и мест связывания модифицирующих групп.
Наряду с масс-спектрометрией важную роль в исследованиях протеома играют базы данных по белкам, меткам сиквенса (ехргеззед зейпепсе 1ай) и сиквенсу генома в целом, комплекс программного обеспечения для коррелирования известных белковых сиквенсов с данными масс-спектрометрических экспериментов, а также методы выделения и очистки белков. Говоря о приложениях протеомики, можно, прежде всего, выделить следующие: 1. Прямой поиск (ппшпй) — работа по идентификации максимального числа белков в каждой пробе. Цель — получить информацию о протеоме напрямую, а не опосредованно через информацию о сиквенсе (последовательности) генов. 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
