А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Благодаря возможности вычисления молекулярной массы, пользуясь любой парой соседних пиков, можно провести очень точное измерение, усреднив полученные значения. В настоящее время, когда определены последовательности аминокислотных звеньев миллионов различных пептидов и белков, полностью или частично расшифрованы геномы самых разнообразных организмов, во многих случаях определение молекулярной массы полипептида или белка позволяет установить его структуру.
Этот процесс достаточно эффективно осуществляется при использовании компьютерных баз данных (например, БскЬзрго1). Если белок с полученной массой отсутствует в базах данных и существует необходимость установления его структуры, оптимальным вариантом является энзиматическое расщепление молекулы с последующим масс-спектрометрическим анализом его фрагментов. Часть этих фрагментов могла быть изучена ранее, а соответствующая информация присутствовать в компьютерных базах данных. С остальными фрагментами надо вновь проводить процедуру биохимического расщепления с установлением молекулярных масс и строения фрагментов уже второго поколения.
Когда молекулярные массы продуктов расщепления будут составлять 1-3 кДа, можно будет использовать процедуру масс-спектрометрического определения последовательности аминокислотных звеньев. 8.15.1. Установление последовательности аминокислотных звеньев в пептидах Пептиды являются сложными молекулами, состоящими из тысяч атомов. Поэтому количество возможных путей фрагментации их молекулярных ионов практи- 8.15. Аминокислоты, пептиды, белки 315 .К4.У4 24 . "3 Уз .
23 .К2.У2 . 22,. "1.У1 - 21 Н2Х вЂ” СН-, 'С-+ХН+СН-', С-+ХН+-СН-,', С-'1 ,ХН-', СНфС-, 'ХН+СН вЂ” С-ОН +2н1 , '~ +2н) 1 1 +2Н, ~, +2Н1 аГ Ь1 сГ а5 Ь5' с2 аз Ьз сз а4 Ь4 с4 Рнс. 8.135. Основные направления фрагментации молекулярного иона пептнда СЯСКк' чески не ограничено и определяется конкретной структурой каждой индивидуальной молекулы. Однако основные направления распада оказываются общими для всех соединений этого класса. Они связаны с разрывами пептидных связей вдоль скелета молекулы с образованием характеристических серий ионов [433, 4351.
Безусловно, качественные масс-спектры требуют применения тандемной масс-спектрометрии [гл. 7). Большинство белков состоит из 20 аминокислот, представленных в таблице в приложении 2. В этой таблице наряду с химической формулой представлены их трехбуквенный и однобуквенный шифры и массы их остатков (фрагментов пептида). Поскольку на одном конце пептнда находится аминогруппа, а на другом — карбоксильная группа, масса пептида равна сумме масс остатков аминокислот плюс 18 Да (вода).
Поскольку лейцин и изолейцин имеют одинаковые массы, для их идентификации приходится использовать дополнительные пики [не связанные с расщеплением пептидной связи). Для распознавания изобарных лизина и глутамина необходимо проводить ацетилирование исходного пептида [лизин ацилируется, а глутамин нет), а затем повторять масс-спектрометрический анализ.
Эти моменты являются недостатком масс-спектрического подхода по сравнению с биохимическими анализами. Для установления последовательности аминокислотных звеньев в пептидах используют метод тандемной масс-спектрометрии. Анализу, как правило, подвергается однозарядный протонированный молекулярный ион пептида. Благодаря предпочтительным разрывам конкретных связей молекулярного иона в спектре доминируют пики ионов, образующихся в результате элиминирования одной, двух, трех и т. д. аминокислот. Величины я/2 фрагментных ионов указывают на исходную последовательность аминокислот в пептиде.
Рассмотрим протонированный молекулярный ион пентапептида в общем виде [рис. 8.135). Первая классификация общих фрагментов, образующихся при распаде пептидов, была предложена Ропшторфом в 1984 г. [4351. Несколько позже К. Биманом была предложена несколько отличная номенклатура [4361. В зависимости от того, какая связь рвется и на какой части молекулы сохраняется заряд (на Х- или С-конце), выделяют несколько серий ионов. Фрагменты, в которых заряд сохраняется на С-концевой части исходной молекулы, изоб- 316 Глава 8, Основные направлении фрагментации органических соединений С ! + Н,Х-СН-С=О ь! С О !! + НаХ СН С ХНз с! С О Я ! !! ! + Н,Х вЂ” СН-С вЂ” ХН вЂ” СН-С=О Ьт + Н«Х=СНС а! + + + + К О Ъ СН СООН НзХ а Па СООН О= С НХ л Н СООН НзХ ~Н С НХ И Н СООН У! «! У2 Рис.
8.136. Струатуры некоторых фрагментов пептида СЗСК«' ражаются символами Х, Ъ' и Х, а фрагменты, в которых заряд сохраняется на Х-юнцевой части исходной молекулы,— символами А, В и С 1рис. 8.135). Различия в номенклатурах Ропшторфа и Бимана заключаются лишь в том, что во втором случае ионы обозначаются строчными, а не заглавными буквами, а ионы серий у и с образуются в результате не простого разрыва С вЂ” О-связи, а разрыва с миграцией двух атомов водорода к заряженному фрагменту, что, кстати, соответствует действительности. На рисунке 8.136 представлены структуры нескольких фрагментных ионов серий а, Ь, с, х, у, а, образующихся при распаде в результате активации соударением МН+ пентапептида (рис.
8.135). Наиболее характеристичными при использовании низ коэн ергетических столкновений оказываются ионы серий у и Ь. Они образуются в результате разрыва амидной связи, а их пики, как правило, доминируют в спектре. Например, в спектре пентапептида СЯСКа' должны наблюдаться пики ионов с и/г 528, 441, 404, 338, 248, 182„145, 58. Реальный масс-спектр оказывается куда более сложным. Первичной задачей является поиск двух ионов, масса которых отличается от массы протонированного молекулярного иона на массу остатка какой-либо кислоты и на сумму масс аминокислотного остатка и молекулы воды.
Первый ион открывает у-серию, а второй — Ь-серию. Последующие пики ионов обеих серий отстоят друг от друга на массы аминокислотных остатков (табл. 2 приложения). Практически ниюгда не удается дойти до конца серий у и Ь. В области низких масс интенсивности соответствующих пиков очень низкие. Иногда пики отсутствуют вовсе.
Поэтому важно приступать к расшифровке последовательности с двух сторон. Если удалось дойти до места, где серий у и Ь начинают перекрываться, задачу можно считать решенной. Большое юличество пиков других ионов делает масс-спектр многолинейчатым. Зачастую установить пики ионов серий у и Ь не так просто, поскольку их интенсивности существенно ниже, чем интенсивности пиков ионов других типов. На интенсивности пиков характеристических ионов влияют несколько факторов: различия в легкости разрыва пептидной связи между разными аминокислотами, дополнительные выгодные направления фрагментации юнкретных аминокислот и эффект присутствия пролила.
Легкость разрыва пептидной связи параллельна легкости протонирования данного атома азота. Чем легче протонируется конкретная пептидная связь, 8.)5. Аминокислоты, пептииы, белки 317 СНг ~СНг ~сн ( СНО К О .6н-с-бчн-сн-с')„-он+ н+ г.л+ 1 ,О К О и ! к — с — бчн — сн-с)„: — он + и'л -сгнг' СН, сН СНг О К О + у! !! ! и ,н — ~ — с-бчн — см-с)„— о 0 К 0 + к ! !! ~х ==сн — с — (ын — сн — с ) — О л — С4Н! 0 ул Ул+1 К ! О Снг + Н вЂ” (НН вЂ” СН вЂ” С) — ХН вЂ” СН .
л К 0 СН ! )! !! + Н-(Хн-СН-С)-)Чн-СН л 41л ал+1 Схема 8.108 тем более интенсивными будут пики, обусловленные ее разрывом. Кислотные группы боковых цепей аминокислот могут стабилизировать положительный заряд, поэтому разрывы пептидной связи рядом с глутаматным или аспартатным остатком нередко приводят к интенсивным пикам в спектре. Очень часто повышенной интенсивностью обладают пики ионов, образовавшихся в результате разрыва амидных связей в центральной части молекулы.
Подробнее с механизмами диссоциации пептидной связи можно познакомиться в работе [437) и цитированной в ней статьях. Если на Х-юнце молекулы находятся аргинин или лизин, в масс-спектре будут доминировать пики ионов серии Ь. Если эти аминокислоты замыкают С-юнец пептида, наиболее интенсивными будут пики ионов серии у [438).
Некоторые боковые группы аминокислот отвечают за специфические направления фрагментации, не связанные с разрывом пептидных связей. В частности, серии и треонин, содержащие гидроксильные группы в боковых цепях„лепсо отщепляют молекулу воды. Аналогично, молекула сероводорода легко отщепляется цистеиновым фрагментом. Интенсивность таких побочных ионов может значительно превосходить интенсивность пиюв основных характеристических ионов.
На схеме 8.108 представлен процесс отщепления боковой группы с образованием иона и. Аналогичным образом, с участием боковых групп образуются 318 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений о47 9 ~ю гю ие ~ю юв гю лю вю вю ~юе ~ и» ою ~яи Рнс.8.137. Спектр высокознергетнческой активации соудареннем МНт олнгопептндв йККРСгЯРРОЬМ с т/г 1348,7 ионы серий с1 и в (схема 8.108). Кстати, высокоэнергетические столкновения приводят к спектру, в котором доминируют пики ионов серий а и Ы (рис. 8.137).
Регистрация этих ионов дает возможность подтверждать установленную по основным ионам последовательность аминокислот, а также различать изомерные лейцин и изолейцин. Пролил обладает специфическими свойствами. Например, он препятствует расщеплению пептидной связи трипсином, если связан с С-концом лизина или аргинина. Аналогичный эффект наблюдается и в случае масс-спектрометрического распада.
Пептидные связи пролила оказываются очень устойчивыми, и соответствующие ионы серий у и Ь могут отсутствовать в спектре. Этот эффект пролила можно объяснить его структурой (гв-пирролидинкарбоновая кислота). Пирролидиновый цикл, включающий и гв-атом углерода, и аминогруппу в пептидной цепи, имеет очень низкую основность. Его протонирование, а следовательно, и соответствующий распад крайне затруднены.
Иногда для проверки или для более надежного установления сиквенса пептиды дериватизуют и проводят повторный анализ. Например, обработка пептида раствором НС1 в метаноле позволяет прометилировать все свободные карбоксильные группы. 835. Аминокислоты, пептилы, белки 319 ((Л.)Ь(СЬ)ЬСВЧЧЯНЧЧРА1ЧСНГ-Ь)Н, Ч Ч Р А 1 Ч С Н Р (ХНз) 1232 гпlг (Ъ'+2) Ч 8 С 1 (1.С) Ь (1.С) 8 Н С (РА1) Ч Ч Н Рис. 8.138. Масс-спектр активации соударением протонированного молекулярного иона пептида (СЬ)Ь(СЬ)ЬСНЧЧБНЧЧРА1ЧСНР— ХНт На рисунке 8.138 представлен реальный масс-спектр (МС/МС) МН+ пептида состава (ОЬ)Ь(ОЬ)ЬОБЧЧЯНЧЧРА1ЧОНР— ХНт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
