А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 61
Текст из файла (страница 61)
Поиск изменений состава белков организма (рго1еш-ехргезз(оп ргоб1ш8) идентификация белков в образце в зависимости от состояния системы (организма, клетки). Имеется в виду стадии размножения, роста, болезни нли реакция на воздействие лекарств, химических или физических факторов. Например, сравнение белков здоровой и больной клеток позволяет получать важнейшую информацию, которую в дальнейшем можно использовать в диагностике болезней, выявлении мишеней для последующего медикаментозного лечения. 3.
Установление межбелковых взаимодействий (рго1еш-пе1ссог1с шарр(пй), которые определяют, каким образом белки взаимодействуют друг с другом в живом организме. Поскольку большинство функций организма обусловлено не индивидуальным белком, а их совокупностью, информация о взаимодействиях белков имеет первостепенное значение (460). Ряд биохимических подходов для изучения взаимодействий белок — белок был адаптирован для применения метода молекулярного дробления [446).
Чувствительный метод для установления межбелковых взаимодействий включает связывание белка с твердой подложкой, используемой в качестве «нажнвки». Клеточный экстракт выливается на такую подготовленную поверхность, и белки с высоким сродством к иммобилизованному белку задерживаются. Метод позволяет детектировать ассоциаты с константой связывания до 10 ~, что объясняется высокой концентрацией неподвижного компонента (460). Модификацией этого метода, когда прямо за связыванием проводится масс-спектрометрический анализ 1187, 188), является метод поверхностной матричной лазерной десорбционной ионизации (разд.
5.14). Другим методом идентификации межбелкового связывания является использование антител для соосаждения взаимодействующих белков. Обычно аль, нуклеииовые кислоты 325 короткая последовательность аминокислот встраивается в анализируемый белок, образуя эпитоп, для связывания которого имеются подходящие антитела. За стадией осаждения следует стадия масс-спектрометрического анализа. Изучению взаимодействий белок †бел и белок †лига посвящен ряд специализированных статей и обзоров [461-4661. Результаты определений от первичной до четвертичной структуры белков и межбелковых взаимодействиях опубликованы в работе [467]. 4.
Картирование белковых модификаций направлено на установление того, в какой момент, каким образом, по какой причине, в каком месте клетки белки приобретают модифицирующие группы. Многие распространенные посттрансляционные изменения белков определяют их пространственную структуру, назначение и функциональные особенности. Модификации обусловлены не только эндогенными причинами, но и влиянием лекарств, химических соединений, поступающих в организм из окружающей среды. Кстати, основополагающей характеристикой белка является информация о том, в каком месте клетки он находится.
Задачи белков ядра, цитоплазмы или клеточной мембраны различны. Поэтому место локализация белка — первый шаг определения его функционального назначения. 8.16. Нуклеиновые кислоты Будучи еще более сложными, чем полипептиды и белки, биополимерами, нуклеиновые кислоты долгое время были вне рамок досягаемости масс-спектрометрии. До 90-х годов ХХ века более или менее значимых результатов удавалось добиться с использованием ББА (разд. 5.10) или плазменной десорбции (разд. 5.8). Эти методы позволили получать спектры молекул с несколькими (до 10) нуклеотидами в цепи [468, 469). Прорыв произошел с внедрением в практику исследований электрораспыления (разд.
5.12) и матричной лазерной десорбционной ионизации, МЛДИ (разд. 5.14). Несколько хороших обзоров посвящено результатам анализов нуклеиновых кислот этими методами [470-4721. С каждым годом масс-спектрометрия все более активно используется для установления молекулярных масс и состава нуклеиновых кислот, последовательности нуклеотидов, а также для структурного анализа их аддуктов с самыми разнообразными соединениями, включая лекарственные препараты, металлы, белки и вещества, загрязняющие окружающую среду [473, 4741. Рекордная масса, зарегистрированная масс-спектрометрически [7), принадлежит ДНК колифага Т4.
Тем не менее следует отметить, что получить качественный масс-спектр нуклеиновой кислоты значительно сложнее, чем масс-спектр белка с такой же молекулярной массой. Звенья цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты (дезоксирибонуклеотиды) состоят из моносахарида 8-П-2-дезоксирибофуранозы (ЧП1-7), фосфатной группы и одного из четырех азотистых оснований (аделин — Ч1П-2, тимин — ЧП!-4, гуанин — ЧП1-3, цитозин — ЧШ-5), представленных на рис.
8.141. Звенья цепи 326 Глава 8. Основные направления фрагментации органических соединений Он 4 В1Н2 (Ь Н х'Ш-2 иц-б ч'ПЬ8 Рис. 8.141 4~5.Х5.У5 Л5 м4 Р4,У4..Х4 .хвЗ..хь..уз..ХЗ ..мл,х2,,М,,Л2,4вз.хЬ.У1,2! НО 1',~~~ (,~ ~ $ 4х~ ~;Ол! А~ ' ' гЦ :.:ь: М.:ь: 4 ' .> .! .1 > ..-',.-',=',.' ..- .-,.-' ..: ..-' ..' ..' ...:.>,.-' аГ Ь1 сГ Йг ат'ь1 с2 И2' а1 Ьз с1'И1 ав Ь4 св а4 а1 Ь5 Й Й Рис. 8.142. Основные направления фрагментации молекулярного иона гексамера ДНК рибонуклеиновой кислоты (рибонуклеотиды) состоят из моносахарида,9-13- рибофуранозы (Ч111-8), фосфатной группы и одного из четырех азотистых оснований (аденин, урацил — ЧП1-6, гуанин, цитозин), представленных на рис.
8.141. Пуриновые основания (аденин и гуанин) присоединяют рибозный фрагмент по атому азота Х9, а пиримидиновые основания (тимин, цитозин, урацил) — по атому азота 1ч(1. Фураноза присоединяет все основания по атому углерода С1 сахара. Образующиеся нуклеозиды соединяются друг с другом через гидроксильные группы в положениях 3 и 5 фуранозного цикла посредством фосфатных групп. На рисунке 8.142 представлен фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты. Для упрощения записи фуранозный фрагмент обозначают вертикальной чертой, фосфатную группу часто обозначают буквой Р в круге, а основание первой буквой его названия.
Молекулу принято располагать по горизонтали, причем на левом краю находится фураноза с незанятой гидроксильной группой в положении 5, а на правом — в положении 3. Среди многочисленных процессов фрагментации молекулярных ионов нуклеиновых кислот в масс-спектрометре особую ценность имеют те, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов.
Аналогично фрагментации пептидов была разработана классификация характеристических серий фрагментных ионов, образующихся при распаде нуклеиновых кислот (4751. На рисунке 8.142 представлены основные серии ионов для гексамера. Се- 8.!б. Нуклеииовые кислоты 327 рии а, Ь, с, с( включают фрагменты со свободной гидроксильной группой в положении 5 (левая часть молекулы). Серии и, х, у, г включают фрагменты со свободной пщроксильной группой в положении 3 (правая часть молекулы). Поскольку основная цепь нуклеиновых кислот характеризуется четырьмя типами разрывов с каждой стороны (в отличие от пептидов с тремя типами рщзывов), обозначения Ы и и относятся не к побочным, как в случае пептидов, а к основным ионам.
Основание обозначается В„, где и — положение данного основания относительно конца молекулы со свободной 5-гидроксильной группой. Аббревиатура а4 — ВЗ(С) означает фрагментный ион серии а по четвертому положению исходной молекулы, который дополнительно выбросил цитозин из положения 3. Достаточно сложно оказалось подобрать матрицу для МЛДИ-анализа нуклеиновых кислот.
В частности, хороших результатов удалось добиться в замороженной водной матрице на медной подложке. При облучении образца лазером с длиной волны 578 или 589 нм в газовую фазу переходят неразрушенные молекулы, содержащие до 600 азотистых оснований в цепи [476-478). Недостатком этого подхода является плохая воспроизводимость. При использовании смеси 3-гидроксипиколиновой и пиколиновой кислот в качестве матрицы и лазера с длиной волны 266 нм [479] удалось получить масс-спектры двойной спирали нуклеиновой кислоты с 500 основаниями в цепи (т/я > 160000).
Кстати, во время пробоподготовки и анализа происходит денатурирование молекулы, поэтому в спектрах проявляются только пики ионов одной цепи [480]. Еще в ранних исследованиях методом МЛДИ было отмечено, что интенсивность масс-спектрометрического сигнала зависит от природы нуклеотидов. Самым высоким фактором отклика характеризуется тимин, а РНК дают более интенсивные сигналы, чем ДНК.
Кроме того, МЛДИ позволяет получить спектры РНК более тяжелых по сравнению с ДНК [481-483]. Эффект тимина обьясняется меньшим сродством к протону по сравнению с остальными нуклеотидами [484]. Поскольку первичные реакции фрагментации инициируются протонированием азотистого основания, за которым следует 1,2-транс-элиминирование (Е2) с разрывом С вЂ” Х-гликозидной связи [485, 486], тиминовые фрагменты оказываются более устойчивыми. Поскольку процесс элиминирования включает атом водорода в положении 2 фуранозного цикла, наличие в этом положении гидроксильной группы в случае РНК в определенной степени препятствует фрагментации, приводя к большей стабильности молекулярных ионов РНК по сравнению с ДНК [486). Еще одной проблемой анализа нуклеиновых кислот является необходимость использования максимальной разрешающей способности прибора, поскольку уже для олигомера с 15 основаниями существуют по одному изобарному иону каждой целочисленной массы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
