А.Т. Лебедев - Масс-спектрометрия в органической химии (1111819), страница 65
Текст из файла (страница 65)
Комментарии преимущества масс-фрагментографии высокого разрешения излишни. Вариантами масс-фрагментографии являются анализы с использованием тандемной массспектрометрии. Методы связанных сканиронаний с регистрацией спектров дочерних ионов, 344 Глава 9. Количественный масс-слектрометрический анализ родительских ионов и выбросов идентичных нейтральных частиц (разд. 7.2) фактически представляют собой методы мониторинга заданных ионов и используются для поиска в смеси конкретных соединений.
Регистрация пика свидетельствует о присутствии искомого соединения в смеси, а измерение площади соответствующего пика в спектре позволяет провести количественное определение. Помимо экологических исследований 1527] масс-фрагментографня и масс-спектрометрия в целом широко используется при разработке и испытаниях лекарственных препаратов «528], а также в медицинских анализах, для установления уровней исходных препаратов и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях 128].
9.3. Установление количества соединения в образце по площади хроматографического пика Простое интегрирование площади хроматографического пика (любого типа) соединения не означает автоматического установления его концентрации в анализируемом образце. Площадь пика зависит от нескольких параметров. 1. Сечение ионизации. Любое органическое вещество характеризуется своей уникальной величиной сечения ионизации, т. е. количеством ионов, образовавшихся из молекул в условиях эксперимента. В разделе 2.1 было сказано, что в условиях электронного удара примерно одна из 10000 молекул ионизируется. Эта величина зависит от структуры соединения и может изменяться в широком диапазоне. Это означает, что одинаковые навески двух разных веществ после ионизации приведут к возникновению разного количества ионов.
Как следствие, площади пиков что на хроматограмме в полном ионном токе, что на массхроматограммах и масс-фрагментограммах будут существенно отличаться. 2. Дискриминация по массе. Анализатор масс любого типа пропускает ионы с разными значениями тl~ по-разному. В результате 100 ионов с тlя 56 дадут пик с интенсивностью, отличной от пика 100 ионов с и/г 326. Этот процесс мало сказывается на интенсивности пиков на хроматограммах по полному ионному току, но важен для масс-хроматографии и масс-фрагментографии. Если два соединения имеют существенно отличающиеся молекулярные массы, то дискриминация по массе скажется и на интенсивностях хроматографических пиков по полному ионному току.
3. Доля тока характеристического иона в полном ионном токе зависит от природы соединения. Например, доля характеристического иона бенз1а]пирена с тЬ 252 в полном ионном токе этого соединения составляет 52%, тогда как 9.4. метод внешнего стандарта 345 доля характеристического иона 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксина с т/г 324— менее 10%. Эти сложности заставляют использовать для количественного масс-спектрометрического анализа специальные стандарты. Математическая зависимость, связывающая площади пиков стандарта и искомого вещества, а также известное количество используемого стандарта, позволяет проводить количественное определение с высокой точностью.
9.4. Метод внешнего стандарта Метод заключается в приготовлении стандартного раствора соединения, которое требуется проанализировать. Известный объем этого раствора вводится в прибор. Измеряется интенсивность сигнала, т. е. устанавливается зависимость между количеством введенного соединения и интенсивностью его сигнала. Затем, не изменяя никаких условий эксперимента, в прибор вводится такой же объем анализируемой пробы, и вновь измеряется интенсивность сигнала анализируемого соединения.
В диапазоне линейности зависимости количество образца — интенсивность регистрируемого сигнала рассчитать количество анализируемого вещества в пробе можно, используя простейшую формулу 9.1: (9.1) где М вЂ” количество определяемого соединения в объеме, введенном в прибор, 5 — интенсивность сигнала определяемого соединения, гс — фактор отклика, равный отношению количества соединения, введенного в прибор из стандартного раствора к интенсивности его сигнала (М„/5 ). Для электронного удара зависимость количество образца — интенсивность регистрируемого сигнала сохраняет линейность в широком диапазоне (до б порядков). В случае других методов ионизации диапазон линейности уже в связи с протеканием в источнике ионов побочных процессов.
Поэтому для проведения количественного анализа требуется построение калибровочного графика. Для этого в прибор вводятся одинаковые объемы стандартных растворов, содержащих разные известные количества анализируемого соединения. На основании интенсивностей полученных сигналов строится график. В идеале, это должна быть прямая, продолжение которой должно проходить через начало координат.
К сожалению, метод внешнего стандарта зачастую приводит к значительным ошибкам. Это связано с невозможностью абсолютного совпадения обьемов пробы, вводимой в прибор, а также с изменениями работы масс-спектрометра в течение проведения калибровок и анализа. Небольшие изменения, связанные с величиной напряжения на различных линзах, с изменением потока газа-носителя 346 Глава 9. Количественный масс-слектрометрический анализ или с делением потока в сплиттерном режиме, с давлением в источнике ионов делают два последовательных анализа не абсолютно идентичными. Эти различия возрастают при проведении анализа большой серии образцов в течение дня.
В связи с этим общепринятым является предпочтительное использование метода внутреннего стандарта. 9.5. Метод внутреннего стандарта Яи х М„ Я, х Мл (9.2) где ГтР— фактор отклика (геаропзе ТасЮг), М вЂ” количество соединения, в данном стандартном растворе, э — интенсивность сигнала соединения; индекс и относится к внутреннему стандарту, а индекс х — к определяемому соединению. Величина фактора отклика может изменяться в широком диапазоне в зависимости от природы определяемого соединения и внутреннего стандарта. На зту величину влияют, прежде всего три фактора, рассмотренные в разд. 9.3.
Для В этом случае интенсивности сигналов анализируемых соединений сравниваются с сигналом стандартного вещества, которое добавляется непосредственно в образец, вводимый в прибор. Такой стандарт может использоваться для одновременного определения многих соединений, присутствующих в анализируемом образце. Поскольку внутренний стандарт добавляется непосредственно в анализируемую пробу, все перечисленные выше недостатки метода внешнего стандарта устраняются.
В качестве внутреннего стандарта может использоваться любое вещество, важно только, чтобы оно бьшо чистым, не реагировало с растворителем и другими компонентами смеси и отсутствовало изначально в анализируемом образце. В связи с этим широкое распространение, особенно для анализа объектов окружающей среды, получили соединения, меченные изотопами П, 'зС, ым 'вО и т. д. Анализ начинается с последовательного введения в прибор серии стандартных растворов, с точно известным содержанием внутреннего стандарта и соединений, которые планируется анализировать в дальнейшем. Количество внутреннего стандарта в этих растворах, как правило, одно и то же, хотя это и не обязательно.
Его концентрация должна попадать в середину диапазона потенциальных концентраций анализируемых ингредиентов в пробах. Концентрации ингредиентов в стандартных растворах должны перекрывать весть диапазон их предполагаемых концентраций в пробах. Обычно концентрационный диапазон составляет 2 — 3 порядка.
В этом диапазоне зависимость регистрируемого отклика от концентрации пикейна, т. е. фактор отклика, рассчитанный по формуле 9.2, должен быть постоянным. 9.5. Метод внутреннего стандарта 347 получения достоверных результатов фактор отклика должен быть как можно ближе к единице. Если фактор отклика составляет менее 0,1 или более 10, для анализа данного ингредиента желательно подобрать другой внутренний стандарт.
После завершения работ со стандартными растворами приступают к анализу образцов. Для этого в образец добавляется точная навеска внутреннего стандарта. Концентрация внутреннего стандарта должна примерно соответствовать величине, использованной для определения факторов отклика. Такой вариант количественного анализа можно использовать в любой из перечисленных выше модификаций: хроматограмма по полному ионному току, масс-хроматография или масс-фрагментография. Расчет количества анализируемого вещества в пробе осуществляется по формуле 9.3. Ю хм„ М = КР х Ян (9.3) где М вЂ” количество анализируемого соединения в пробе, 5 — площадь пика анализируемого соединения, Вà — фактор отклика, Мн — количество введенного внутреннего стандарта, Ял — площадь пика внутреннего стандарта.
Для измерения площадей пиков можно использовать масс-хроматограмму, масс-фрагментограмму или хроматограмму по полному ионному току Существуют разные варианты того, в какой момент лучше добавлять внутренний стандарт к пробе. Эту процедуру можно осуществлять в любой момент от отбора пробы до введения ее в прибор.
Если внутренний стандарт по своей природе очень близок определяемым соединениям, лучше добавлять его как можно раньше. В этом случае на всех стадиях пробоподготовки (экстракция, очистка, концентрирование) его потери будут адекватны потерям анализируемых ингредиентов, и конечный результат будет точнее соответствовать реальной концентрации вещества в пробе. Однако если свойства внутреннего стандарта существенно отличны (например, он хуже экстрагируется используемым растворителем или его летучесть значительно выше, чем у определяемых компонентов), лучше добавлять его на поздних стадиях пробоподготовки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
