И.Л. Кнунянц - Химическая энциклопедия, том 3 (1110089), страница 193
Текст из файла (страница 193)
Определение иерввчвой структуры (ееввеввронвиие) Нле. Секвенярование Нл. позволяет определвть в одном эксперименте последовательность нухлеотидов в ДНК или РНК, содержащих песк. сотен мономервьех звеньев. Методы основаны на общем принципе-определении с номощью высокоразрешшощего злектрофореза в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотвда длияы всех возможных фрагментов секвенируемого участка Н.к., содержащих на одном конце одну и ту же последовательность нуклеотидов (гомогенный фрымеят), а на другом-один и тот же нуклеотяд.
Такие фрагменты получают двумя разл. способами. В первом случае (метод Максама-Гилберта) гомогенный фрагмент ДНК или РНК, предварительно меченный радиоактивной меткой по одному ю концов, расщепляют хим. агентами, специфичными к одному из четырех нуклеотвдных остатков (А, О, С, Т илн ~3); в случае РНК этот МеОТгОСН В, гнрнанн 1 О Р-О МеОТгОСН В, ОН О + ОРОСНг Вг о НО ОСН В ОАс ОАс МеОТгО Нг Вэ ΠΠР— О ОСНг Вг ОН МсОТгО ОН Вг + О ОН МОРО 1 О ОАе МеОТгО ОН МсОТгО 590 589 процесс осуществляют также специфич. Рибонуклеазами. Расщепление ведут а таких ограничивающих условиях, когда н каждой молекуле Н.к. Расщепляется только одна межнуклеотидная связь рядом с нуклеотидом даяного типа, независимо от его положения а цепи.
Такую операцию проводят для каждого из четырех нукчеотидных остатков и по длинам образующихся радиоактивных фрагментов определяют положение каждого ыуклеотида а цепи Н.к. В др. случае (метод Сепгера) используют олиго- илн полинуклеотидную затравку (праймер) известной длины, коплементарную определенному участку Н.к. Загранку паращиаают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов нуклеотндных остатков с рампой аероятностью, независимо от его положения а цепи. Для этого к смеси четырех прир. субстратоа ДНК- полимеразы добавляют т.наэ. терминатор (обычно 3', Зчдидезоксиыуклеозидтрифосфат) — аналог определяемого нухлеотидиого остатка, попадание к-рого иа 3'-кояец растущей цепи остаиаалиаает синтез.
При этом радиоактивная метка вводится либо а затравку, либо а субстрат. Операцию повторяют для каждого из четырех нуклеотидон; длину образующихся радиоактиаиых фрагмеитоа определяют стандартным способом. Эти методы и настоящее время удалось полностью автоматизировать (замениа а ряде случаен радиоактивную метку на флуоресцентную) и тем самым а тысячи раз понысить скорость секаенироааиия ДНК. Получение Н.н. В клетках Н.к. саязаиы с белками, образуя нуклеопротеиды. Выделение Н.к.
сводится преим. к очистке их от белков. Для этого препараты, содержащие Нж., обрабатывают ПАВ и эксграгнруют белхи феполом. Послед. очистка и фракциониронание Н.к, проводятся с помощью ультрацентрифугиронания, разл. видов жидкостной хроматографии и гель-электрофореза. Для получения инпияидуальных Н.к. обычно используют разл. варианты последнего метода. Совр.
методы хим. синтеза Н.к. позволяют получать крупные фрагменты ДНК, а т.ч. целые гены. Методич. основы хнм;ферментатинных методов синтеза ДНК разработаны Х. Кораиой. Оии акшочают: 1) хим. синтез комплементарных, взаимо перекрыяаюшихся олигонуклсотидоа, из к-рых затем и результате комплементацнониых азаимод. выстраиваются дуплексы — фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несо»падающими разрывами н обеих цепях; 2) соединение (лигироаание) таких олигонуклеотидон а составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы.
Сборку протюкенных ДНК из синтетич, однотяженых олигоиуклеотидоа проводят а песк. эталон (рис. 4). Сначала (а) г о~- с — о- о — о — о- о- о — о — о- о- о- НУКЛЕИНОВЫЕ 299 собирают небольшие дуплексы с «люшими» концами (одыотяжеаыми комплементарными участкамн), из к-рых затем последоаательио (б, а и т.д.) формируют более протяженные структуры. Т.
обр. могут быть получены искусстн. фрагменты ДНК болыпой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью гснетич. июкеиерии аозможно клонирование (получение а иыдиаидуальном виде и размножение) искусств. ДНК. Синтез олигодезокспнуклеотидов Корана осущестаил т. наз. фосфодиэфириым методом по схеме: МеОТг л-СН,ОСеН4(СеНе)гС, В, н Вн .нансена с нцнненнммн И Нг-груанамн К динуклеотнду со сноб. 3'-гидроксить грушюй присоединяют таким же способом лпиуклеотид с незащищенной 5чфосфатяой группой и т.д.
(т.наз. блочный метод синтеза): В»Вг,ВзнВс-нснаданм с эаанаеннмнн ННг-грусменн Несмотря на малую эффектпиносп этого метода, бьши синтезированы олпгопуклсотядьь содержащие до 16 зненьев, из к-рых были собраны первые сиитетич. гены. Фосфоди- Рнс. 4. Схема амтеэа полндсзомамвукнаотнда. Г, 2-аоотн. 5З н зоковсц олаго- вукесотвдое; 3 — камолеменмрвме утмсгка коацов дуплексов Уалвмпнм конан)г а, б в н-стасам образонаннн думлехаов (асс стадам хат ализнрпотгл Т4 ДНП-лн- газон). эфирный метод образования межнуклеотидных связей, использоваяный Кораной, имеет историч.
значение. Однако разработанные им приемы введения и избярат. удалеяия защитных групп широко используются в др. методах синтеза Н.к. Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонуклеотидов явилась разработка т.наз. фосфотриэфирного метода, к-рый осуществляют по схеме: фосфита. На рис. показан один цикл наращивашш цепи, к-рый длится 5 — 7 мия и далее повторяется.
После завершения синтеза удаляют защитные группы с рлежнуклеотидных фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы )ь)нл гетероциклов. Липофильную группу (МеО)»Тг удаляют после первого хроматографич. разделения. Др. метод основан на использовании гидрофосфорильного производного нуклеозида: /~ Н Атзо -Х О ья~л О ОРОСН,СН,СН ОС,Н С! О ОРО ! НО ОС,н С! (МеО)лТгО (Ме0)лТг0 в в, в в О ОРО ОС Н С! Ос»алан»а лг ягО О-(-) (Мао),тго (Маб)лТгО 0 (Г) (МвО)лТгО П вЂ” лалнмарнмл наснлсаь После снятия 5чзицитной днметокситритяльной группы возможяо грисоедннеиие след.
нуклеотида, Окисление межнуклеотидиых фосфитньлх групп проводят после завершения синтеза олигонуклеотида. Стандартность операций в твсрдофазном синтезе олигонуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных комлояентов реагентов и р-рятелей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленяым яа нем первым нуклеозидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезнр. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода (МеО)лТг=(л-СНлОСаНл)лСлНлС Образующийся динуклеотид далее (после частичного деблокирования фосфата) конденсируют аналогичным образом с др.
динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в к-ром используют защиту фосфатной грушлы, позволило значит. сократить время синтеза и повысить выходы олигоиуклеотидов. Параллельно этим методам, к-рые осуществляют в р-рах, разрабатывались твердофазные способы синтеза Н.к. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе; нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в р-ре.
Обычно в этом случае на первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью <ожорною> группы к нерастворимому полимеру. Затем его 5чгндроксильную груш!у деблокируют и конденсируют с ну- в, н )-о л Пабнсннраынна Олнсанрнлааснл '" О (МеО)лТгО, ~ ' МаО)л'ТгО ОСН щего Р(П1), В т.паз, амидофосфитном- в, в, способе (рис. 5) нуклеотидным компонентом является эфир Зчамядофосфита дезоксинуклеозида.
Доста- Оь ((() точно Устойчивые амидофосфиты (МаО) Тг Р при протонировании в присут. тетра- ) 99% зола превращ, в сильные фосфори- О (П Н В ~) (МеО)лТгО ОР»'Н(нла СлНу)л ОСН О П АсО 592 зоо нлслкиновык клеотидньгм компонентом. У образующегося полностью защищенного дипуклеозидмонофосфата деблокируют защитную группу в положении 5' и присоединяют след. нуклеотид и т.д.
Наиб, распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов осяованы на использовании нуклеотидного компонента, содержа- лирующие агенты. Схема также вклю част блокирование непрореагнровав шей Зсгидроксигруппы достраиваю щегося олигонуклеотида (кэпироваяис) и окисление межнухлеотицного Р с. 5. Снам» тая»лафа»пото анино»в влитому». лов»илов нмилофосфнтиым моголом; П вЂ” лолвмн. рвый политов», Ру — и»рилли. 59! О ( С ил) н С С (0) С ! ! НО Н В О О. !! Р О + НО ОН ОК ОН Рбз з ОК КО КО К - Н кки асгз ах мигерзбозг- е в, в В, ОН вЂ” О ~С(О)СН(СНз)з КО Х РР-бсгзы.- е-ги К 1!гймН йгК' СН Ч1Х=НН Б1Х ОН 1Чгй' СНН !! О ОН ! К О О Н,НЬ „Н НО г Ннг ! К Чб !Х ЧК носн, К= ч 3' г' ОН ОН в автомате синтезаторе за песк. часов получают 30 — 40-звенные олигояуклеотиды; возможен синтез более чем 100-звенных фрагментов ДНК.
Разработаны сиятезаторы, позволяющие проводить одновременно синтез песк. олигонуклеотидов. Синтез олигорибоиуклеотидов ферментатиаяым путем осуществляют обычно с использованием рибопуклеаз (РНаз) или полинуклеотидфосфорилаз (ПНФаз). В первом случае р-цню осуществляют по схеме: В качестве нуклеотидяого и иуклеозилного компонентов применяют мономеры или олигонуклеотиды. Эту р-цию используют для синтеза ди-, три- и тетрарибонуклеотидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
