Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Прииспользовании более сложного донора ацильной части D-ФГ-глицина удается поднятьмаксимальный выход с 50% до 64% (данные не представлены). В случае двойного мутантаbF256R+aS149R наблюдается 3-кратное улучшение β. Для мутанта bA255R+bF71L такжеудается добиться некоторого улучшения параметра β, что, однако, значительно меньше, чемэффект для мутации по соседнему bF256 остатку. Следует отметить, что замена bF256R143приводит также к 3-кратному увеличению параметра α, что, судя по всему, являетсярезультатом улучшения связывания продукта, что, в свою очередь, является следствиемулучшения связывания нуклеофила.
Однако, введением дополнительной мутации bF71Lудается более чем в 2 раза уменьшить параметр α по сравнению с одиночной мутацией присохранении эффективности ацильного переноса. Наибольший эффект увеличения параметраβ (24 раза) был зафиксирован для двойного мутанта aR145G+bF256R. При этом наблюдаетсясинергизм эффектов от отдельных мутаций. Для параметра α также характерно взаимноеусиление, но уже негативных эффектов. Параметр γ улучшается в 3 раза по сравнению содиночной мутацией bF256R.Для частичного прояснения природы эффекта увеличения параметра β в реакциях 1а и2э был проведен анализ влияния отдельных скоростей на соотношение S/H. Как видно изтаблицы 53, мутация bF256R приводит к существенному уменьшению скорости гидролиза именее значительному уменьшению скорости синтеза.
Можно предположить, что введениеположительного заряда в области нахождения карбоксильной группы 6-АПК приводит кулучшению связывания целевого нуклеофила и, как следствие, возможному ослаблению роликонкурирующего нуклеофила – воды. При этом наблюдаемое уменьшение скорости синтезаможно, предположительно, отнести к возможному отклонению положения атакующегонуклеофила от исходного, характерного для ДТ, в котором он обладает большим числомстепеней свободы.Таблица 53.
Влияние отдельных скоростей синтеза и гидролиза на соотношение S/Hдля иллюстрации влияния замены bF256R.ФерментОИS ОИH ОИS/HУсловия *ДТ111bF256R0,70,15Реакция 1а: 50 мМ 6-АПКbF24A+bF71L952Реакция 2э: 30 мМ 6-АПКbF24A+bF71L+bF256R414Реакция 2э: 30мМ 6-АПК* Эксперименты с мутантными формами проводили в условиях идентичных поотношению к ДТ.144При изучении стереоселективности в реакциях с аминоспиртами было обнаружено,что мутация bF256R приводит к почти 2-кратному увеличению стереоселективности вреакции ацилирования 2-АБ амидом R-МК по сравнению с ecПА ДТ (табл.
54). В 3 раза приэтом улучшается параметр S/H. При комбинации с мутацией bF71L для двойного мутантаbF256R+bF71L наблюдается аналогичное 2-кратное улучшение стереоселективности и S/H посравнению с одиночным мутантом, что приводит, таким образом, к аддитивности эффектов иувеличению параметра стереоселективности в 14 раз (E=111) по сравнению с ecПА ДТ. Такаястереоселективность может способствовать получению оптически чистого продукта (э.и.
98%при условии 50% конверсии). Еще больший эффект (20 раз) достигается при введениидополнительной мутации bN388Q в мутанте bF256R+bN388Q+bF71L (э.и. 99%), для котороготакже характерно высокое значение S/H и каталитической активности, что делает егонаиболее привлекательным для решения поставленной задачи. Также высокой оптическойчистоты можно достичь в случае мутанта bA255R+bF71L. Введение дополнительной мутацииaR145G приводит к 2-кратному увеличению стереоселективности и S/H по сравнению содиночной заменой bF256R.Таблица 54.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов на основе bF256R и bA255R в реакцииацилирования 2-АБ.2-АБ + R-MК амид2-АБ + S-MК амидФерментV0/E0, с-1S/HESэ.и.50%V0/E0, с-1S/HESэ.и.50%ДТ0,40,0212±178%0,30,052,3±0,139%bF71L1,90,354±1596%0,10,161,7 ±0,2(R)26%bF256R0,30,0617±389%0,040,061,6±0,223%bF256R+bF71L0,60,54111±898%0,031,21,3±0,2(R)13%bA255R+bF71L2,00,2682±798%н.д.н.д.н.д.н.д.bF256R+aS149R0,040,0412±285%н.д.н.д.н.д.н.д.bF256R+bN388Q+bF71L0,80,34160±(10)99%н.д.н.д.н.д.н.д.aR145G+bF256R0,20,1335±694%н.д.н.д.н.д.н.д.145В реакции ацилирования ФА (табл.
55) введение мутации bF256R приводит к почти 3кратному увеличению стереоселективности, однако добавление мутации bF71L не приводитк аддитивному эффекту, в отличие от комбинации bA255R+bF71L, где наблюдается 2кратное увеличение стереоселективности по сравнению с одиночным bF71L и более чем 20кратное по сравнению с ecПА ДТ. Интересно отметить, что мутации bF256R и bA255R,которые приводят к заметному улучшению параметров S/H и β в реакции синтезаампициллина, в данном случае не влияют на эффективность ацильного переноса, в то времякак мутация bF71L, приводящая к ухудшению параметров в случае ампициллина, вотношении ацилирования ФА приводит к многократному улучшению эффективностипереноса.Таблица 55. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов на основе bF256R и bA255R в реакцииацилирования ФА.ФА + R-MК амидФерментV0/E0, с-1 S/HESэ.и.50%ДТ1,00,12,8±0,157%bF71L4,4127±193%bF256R0,10,078±178%bF256R+bF71L0,10,120±290%bA255R+bF71L4,00,959±997%Таким образом, мутация bF256R, и особенно в комбинации с aR145G, может бытьрекомендована для значительного улучшения параметров S/H и β в реакциях синтеза беталактамных антибиотиков, а также, наряду с bA255R и в комбинации с мутацией bF71L, дляэффективного разделения рацематов аминоспиртов.
Однако, следует принимать во вниманиеухудшение стабильности при введении аргининовых мутаций.1463.10 Мутагенез для изменения стереоселективности3.10.1 Мутации bF71L, bF71AОстаток bF71 находится в области связыванияамидной части субстрата, образуя Ван-дер-Ваальсовыконтакты с тиазолидиновым кольцом, а также частичноформирует горлышко гидрофобного кармана (рис. 61).ТакжеостатокbF71выполняетроль«зонтика»,экранируя остатки оксианионного центра от воды. Взакрытой конформации остаток находится в стэкинге сbF256. При переходе в открытую конформацию иРисунок61.Остатокструктуре ecПА (1gm9).bF71в смещении bF71, диаметр горлышка (d) увеличивается с6.5 до 8.5 A, и остаток bN241 оказывается болеедоступным для растворителя, что приводит к дестабилизации оксианионного центра.В семействе ПА позиция b71 является высокогруппспецифичной.
В подгруппе 1,содержащей ecПА, остаток в основном представлен F. Аналогично в подгруппе 4,содержащей bmПА, встречается исключительно Y, который дополнительно фиксируется E(bG385 в ecПА), существенно прикрывая тем самым карман связывания. Следует отметить,что в обоих случаях в «комплементарной» позиции b256, за некоторым исключением,представлены аминокислоты, способные образовать пару для стэкинга.
В случае п/гр 2,содержащей afПА, в позиции b71 находится жесткий P, который в случае afПА спрятанвнутри белковой глобулы и не контактирует с субстратом. При этом боковую стенкуформирует уже bY254, соответствующий bF256 в ecПА (рис. 62). Интересно отметить, что вданном случае отсутствие стэкинг пары также открывает доступ к сольватно доступнойполости, которой нет у ecПА (Х, рис. 62). Следует обратить внимание, что в позиции b71также встречаются и маленькие аминокислоты, такие как A (п/г 1) и S (п/г 3), что можетприводить к расширению субстратной специфичности, ввиду, по крайней мере, увеличениясвободной области связывания амидной части. Однако, отсутствие экспериментальныхданных по соответствующим ПА не позволяет проверить предположение.147Рисунок 62. Сравнение структур ecПА:1gm9 (слева) и afПА:3k3w (справа).В литературе описаны мутантные формы ecПА, содержащие замены в позиции bF71.Принимая во внимание указания первых работ по «направленной эволюции» ecПА, в работе[8] авторы получили и детально изучили мутанты bF71C и bF71L.
Было обнаружено 5-10кратное увеличение константы специфичности в реакции гидролиза NIPAB. В работе [55]изучали стереоспецифичность мутанта bF71L в реакциях ацилирования алифатических иароматических аминоспиртов. Было показано 3-4-кратное улучшение стереоселективности вреакциях с 2-АБ и ФА по сравнению с ecПА ДТ.Согласуясь с предшествующими работами в отношении кинетики гидролиза NIPAB,нами были получены данные, представленные в таблице 56. Так, для мутанта bF71Lхарактерно 5-кратное, а для bF71A почти 2-кратное улучшение константы специфичности.При этом наблюдается относительно малое 3-4-кратное падение термостабильности.Таблица 56. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутантов bF71L/A.NIPABФерментДТkcat, c-1pH 7,5; 50°CKM, µM kcat/KM28,0±0,6 23,1±0,8kin, мин-11,26,0±1,0·10-3bF71L50±210±15,02,2±0,1·10-2bF71A21±29±12,31,6±0,2·10-2148В реакции 1a для мутанта bF71L наблюдается более чем 2-кратное улучшениепараметра относительной специфичности α, однако немного уменьшается параметр β.Параметр γ ухудшается более значительно (табл.
57).Таблица 57. Кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и мутанта bF71LФерментαβ, M-1γДТ13±254±60,05±0,01bF71L7±140±30,30±0,03Для прояснения природы эффекта уменьшения β в реакциях 1а и 2э был проведенанализ влияния отдельных скоростей на соотношение S/H. Как видно из таблицы 58 мутацияbF71L во всех приведенных примерах приводит к асинхронному увеличению скоростигидролиза и уменьшению скорости синтеза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
