Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Можно предположить, что удалениегидрофобного взимодействия в области связывания бета-лактамного кольца приводит кухудшению связывания целевого нуклеофила и, как следствие, возможному усилению роликонкурирующего нуклеофила - воды.Таблица 58. Влияние отдельных скоростей синтеза и гидролиза на соотношение S/Hдля иллюстрации влияния замены bF71L.ФерментОИS ОИH ОИS/HУсловия *ДТ111bF71L0,530,2Реакция1а:50**(bF71L)/70(ДТ) мМ 6-АПКbF24A1243Реакция 2э: 30 мМ 6-АПКbF24A+bF71L952Реакция 2э: 30 мМ 6-АПКbF256R0,70,15Реакция 1а: 50 мМ 6-АПКbF256R+bF71L0,60,32Реакция 1а: 200 мМ 6-АПК* Эксперименты с мутантными формами проводили в условиях идентичных поотношению к ДТ (кроме**).149В отношении стереоспецифичности для мутанта bF71L, действительно, наблюдализаметное (7 раз) улучшение стереоселективности в реакции ацилирования алифатического 2АБ амидом R-МК, более значительное, чем описано в работе [55] для гидролиза N-(R)манделил-2-АБ, однако меньшее по абсолютной величине (табл.
59). Также для данноймутации характерно 15-кратное улучшение параметра S/H и почти 5-кратное улучшениекаталитической активности (см. патентную заявку [132]). Еще большего увеличения удаетсядостичь при замене остатка bF71 на A, так что расчетное значение оптической чистоты приполной конверсии активного энантиомера составляет удовлетворительное значение 98%. Вреакции ацилирования 2-АБ амидом S-МК наблюдается инверсия активной формы, так чтоболее активным становится R-энантиомер.Таблица 59. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов bF71L/A в реакциях ацилирования 2-АБ.2-АБ + R-MК амидФермент V0/E0, с-1 S/HES2-АБ + S-MК амидэ.и.50% V0/E0, с-1 S/HEsэ.и.50%2,3±0,139%ДТ0,40,0212±178%0,30,05bF71L1,90,354±1596%0,10,16 1,7 ±0,2(R)26%bF71A0,40,180±1798%н.д.н.д.н.д.н.д.При ацилировании амидом R-МК ароматического ФА, наряду с 10-кратнымулучшением S/H и более чем 3-кратном увеличением скорости реации, наблюдается ещеболее значительное улучшение стереоселективности, чем в случае алифатического спирта.Так для bF71L характерно 10-и, а для bF71A даже 250-кратное увеличение параметра (табл.60).150Таблица 60.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов bF71L/A в реакции ацилирования ФА.ФА + R-MК амидФермент V0/E0, с-1 S/HEsэ.и.50%ДТ10,12,8±0,147%bF71L4,3127±193%bF71A1,41700±300 99,7%Для объяснения полученных результатов мы провели множественный докингобразующихся в реакции ацилирования отдельных энантиомеров МФА (рис.63) в структурыecПА ДТ и bF71A.OHOH(S)(R)HNHNOO(R)(R)OHOHРисунок 63.
Структурные формулы S-МФА (слева) и R-МФА (справа).Как видно из рисунка 64, в результате всех проведенных докингов в структуру ecПАДТ продуктивная конформация S-МФА занимает строго определенное положение, так чтобензольное кольцо субстрата находится в непосредственной близости с остатком bF71 (рис.64А), тогда как положение продуктивной конформации R-МФА менее определенно (рис.64Б). Этой ситуации отвечает 0,5 ккал/моль разница средней рассчитанной минимальнойэнергии связывания (табл.
48).151АБРисунок 64. Докинг S-МФА (А) и R-МФА (Б) в структуру ecПА 1gm9. Представленырезультаты 7 докингов для конформаций субстрата, характеризующиеся минимальнойрассчитанной энергией связывания.При удалении фенильного радикала в мутанте bF71A появляется свободноепространство, которое становится доступно для фенильного радикала S-МФА (рис. 65А). Вслучае с R-МФА картина практически не меняется, положение продуктивной конформациитакже определено менее строго (рис. 65Б), что находит отражение в более значительнойразнице средней рассчитанной минимальной энергии связывания 1 ккал/моль (табл.
61). Этообстоятельство свидетельствует, по крайней мере, о появлении более существеннойдискриминации энантиомеров на уровне связывания в случае замены bF71A.АБРисунок 65. Докинг S-МФА (А) и R-МФА (Б) в структуру ecПА bF71A. Представленырезультаты 7 докингов для конформаций субстрата, характеризующиеся минимальнойрассчитанной энергией связывания.152Таблица 61. Средняя рассчитанная минимальная энергия связывания на основании 25докингов для каждой пары фермент/субстрат с учетом стандартного отклонения.ФерментДТСубстратS-МФА R-МФА S-МФА R-МФА-dG, ккал/М 6,7±0,4bF71A6,2±0,47,2±0,56,2±0,5Таким образом, можно подтвердить, что позиция bF71 является важной дляспецифичности и стереоспецифичности фермента.
Мутацию bF71L можно рекомендовать дляснижения параметра α в реакции синтеза ампициллина, а также наряду с bF71A дляулучшения стереоселективности в реакции ацилирования аминоспиртов амидом R-МК. Вчастности, мутантная форма ecПА bF71A может потенциально рассматриваться каккатализатор для получения 2-аминобутанола и фенилаланинола в оптически чистой форме.1533.11 Мутагенез для изменения стабильности3.11.1 Мутации bQ292R, bI329EС целью улучшения стабильности ecПА за счетвведения нового электростатического взаимодействиямежду остатками b292 и b266 нами был получен мутантbQ292R. Расстояние между карбонильными атомамиостатков bQ292 и bE266 в структуре 1gm9 составляет4.2Å,чтопозволяетобразованияаргининомсолевогоидействительноговоритьмостикаглутаматом.образуется,омеждуЕслитовозможностивводимымтакойэтомостикприводиткформированию нового и единственного контактамежду соседними альфа-спиралями, как следствие,Рисунок 66.
Остатки bQ292, bE266 ограничениюихподвижностииулучшениюстабильности (рис. 66). Для дополнительной фиксациии bI329 в структуре ecПА ДТ.аргинина также была предложена мутация bI329E. Следует отметить, что подобная системамостиковых взаимодействий реализуется у kcПА (единичный случай среди всех ПА, п/гр1),характеризующейся расширенным в обе стороны профилем pH-стабильности [80].
Также в70% случаев у ГА и в 30% у АГЛА в позиции, соответствующей b292 в ecПА, присутствуетR. В работе [133] методами биоинформатики была построена структура kcПА, что позволилоопределить ионные взаимодействия, отвечающие как за стабильность kcПА, так и заразличия между kcПА и ecПА. Было показано, что в ecПА bR291 образует ионноевзаимодействие с bE475, которое может оказывать существенный вклад в стабильностьфермента. У фермента kcПА остаток bR291 сдвинут на одну позицию за счет вставкилейцина (см. приложение 1.1). Это делает невозможным контакт bR291 с bE475 (как у ecПА),но делает аргинин доступным для тройного взаимодействия с bE327, bD325 и bE265(соответственно bI329, bD327 и bE266 у ecПА).
Таким образом, в двойном мутантеbQ292R+bI329EдляecПАмогутбытьреализованывсевышеуказанныеионныевзаимодействия, характерные для kcПА.154Для изучения термостабильности нами были проведены серии экспериментов поопределению остаточной активности от времени при температуре 50°C и pH 7. Известно, чтодля ПА термоинактивация представляет собой реакцию, характеризующуюся первымпорядком. Таким образом, величину константы инактивации определяли при экстраполяцииполученных экспериментальных данных экспоненциальной кривой (табл. 62).Таблица 62. Константы инактивации для ecПА дикого типа и мутантов на основеbQ292 (pH 7,0; 50°C).Ферментkin, мин-1ДТ7,2±0,1·10-4bQ292R2,1±0,2·10-3bI329E3,0±0,2·10-2bQ292R+bI329E 2,2±0,3·10-3Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что мутация bQ292Rпрактически не сказывается на термостабильности фермента, а мутация bI329E вноситзначительный дестабилизирующий эффект.
Интересно отметить, что в случае двойногомутанта негативный эффект от мутации bI329E нивелируется.Для изучения щелочной стабильности эксперименты проводили при температуре 25°Cи pH 10 (табл.63).Таблица 63. Константы инактивации для ecПА дикого типа и мутантов на основеbQ292 (pH 10,0; 25°C).Ферментkin, мин-1ДТ2,2±0,1·10-3bQ292R1,1±0,1·10-2bQ292R+bI329E 8,3±0,2·10-3155Данные, представленные в таблице 2 свидетельствуют о негативном влиянии мутацииbQ292R на щелочную стабильность фермента - константа инактивации увеличивается напорядок.
Мутация bI329E вносит незначительный позитивный вклад в случае двойногомутанта.Однако, положительный эффект от мутации bQ292R можно наблюдать в областикислых pH. Нами были дополнительно поставлены эксперименты при pH 4,0 и 5,0 (0,1 Мацетатный буфер, T=50°C). Из таблицы 64 видно, что позитивный эффект усиливается приуменьшении pH, а также при внесении фиксирующей мутации.Таблица 64. Константы инактивации для ecПА дикого типа и мутантов (pH 4,0 и 5,0;50°С).kin, мин-1ФерментpH 4,0pH 5,0ДТ1,9±0,1·10-2 4,6±0,4·10-4bQ292R1,5±0,1·10-2 5,5±0,5·10-4bQ292R+bI329E 8,8±0,5·10-3 2,8±0,4·10-4Так, для двойного мутанта bQ292R+bI329E можно наблюдать 2-кратное улучшениестабильности при pH 4 по сравнению с нативным ферментом ecПА.
Этот факт можетсвидетельствовать об активации новых мостиковых взаимодействий характерных для kcПАпри низких pH.1563.11.2 Мутации bD484N, bD484HОстатокрасположенbD484с«обратной» стороны активного центра, водном бета-листе с каталитическим серином,находящемся в структуре альфа-бета-бетаальфа домена. В непосредственной близостирасполагается такой же кислотный bE482(рис. 67), который по расчетам программы«Propka» имеет аномально высокий pKa и,Рисунок 67. Остатки bD484 и bE482 в вероятно, образует водородную связь сструктуре ecПА ДТ, а также молекула воды, отрицательно заряженным bD484 (рис. 68А).координирующая параллельные бета-листы.При высоких pH происходит частичноедепротонированиеиреализуетсяотталкивание соседних кислотных групп, что приводит, в конечном итоге, к потерекоординации воды, разъезжанию двух параллельных бета-листов и заполнению пространстварастворителем (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
