Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 20
Текст из файла (страница 20)
По данным биоинформатического анализа N в позиции b388 являетсяконсервативным в п/гр 1 и 2, также в п/гр 4 стоит изоструктурный D и только в п/гр 3,содержащей abПА, обнаруживается Q. Таким образом, можно сделать вывод, что если вприроде в каком-либо ферменте встречается определенная мутация, это не дает гарантий, чтосоответствующая мутация в гомологичном ферменте приведет к сохранению стабильности.Таблица 47. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутанта bN388Q.NIPABФерментkcat, c-1pH 7; 50°CKM, µM kcat/KMkin, мин-1ДТ28,0±0,6 23,1±0,81,27,2±0,1·10-4bN388Q12,9±0,6 11,2±0,61,27,0±0,4·10-25,21,1±0,1·10-1*bN388Q+bF71L40±27,8±0,5* pH 7,5137В отношении реакции гидролиза NIPAB для данной мутации характерно асинхронное2-кратное ухудшение kcat и 2-кратное улучшение связывания KM так, что константаспецифичности практически не меняется.
Можно предположить, что улучшение KM вызваноулучшением связывания карбоксильной группы NIPAB. При этом, возможно, самосвязывание оказывается менее продуктивным, чем можно объяснить ухудшение kcat.Изменение констант в случае двойного мутанта, выраженные в 5-кратном улучшенииконстанты специфичности, в целом отражает изменение, характерное отдельно для мутацииbF71L (см.
3.10.1).В таблице 48 приведены эффективные кинетические параметры в реакции синтезаампициллина (1а). Для мутанта bN388Q, действительно, характерно некоторое улучшениепараметра β, параметр α не меняется, а параметр γ ухудшается в 3 раза. Мутация bF71Lпревносит лишь изменения характерные для одиночного мутанта.Таблица 48. Кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и мутантов,содержащих замену bN388Q.Ферментαβ, M-1γДТ13±257±30,05±0,01bN388Q14±1bN388Q+bF71L 4,9±0,4185±90 0,17±0,1039±40,23±0,01В таблице 49 представлены данные по стереоселективности мутантов в реакциях срацематами 2-АБ и ФФА.
Видно, что для мутанта bN388Q в реакции ацилирования 2-АБамидом R-МК наблюдается незначительное увеличение стереоселективности, а такжекаталитической активности и S/H. Комбинация мутаций bN388Q и bF71L не приводят каддитивности эффектов по стереоселективности и S/H, однако, наблюдается дополнительноеувеличение каталитической активности в реакции с амидом R-МК. В реакции с амидом S-МКдля двойного мутанта наблюдается 3-кратное улучшение S/H, по сравнению с bF71L, однакопочти в 3 раза уменьшается каталитическая активность, при этом влияние настереоселективность минимально. В случае ФА наблюдается 8-кратное увеличение S/H длядвойного мутанта138Таблица 49.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов на основе bN388Q и bF71L в реакцияхацилирования 2-АБ.2-АБ + R-MК амидФерментV0/E0, с-1 S/H2-АБ + S-MК амидESэ.и.50% V0/E0, с-1 S/HESэ.и.50%2,3±0,139%ДТ0,40,0212±185%0,30,05bF71L1,90,30 54±1596%0,10,16 1,7±0,2(R)26%bN388Q0,60,0319±490%н.д.н.д.н.д.н.д.bN388Q+bF71L3,10,2837±795%0,050,51,6±0,1(R)23%В реакцииацилирования ФА для точечного мутанта наблюдается понижениекаталитической активности в 3,5 раза, при этом стереоселективность и синтетическаяспособность мутанта практически не меняются (табл. 50). Для двойного мутанта наблюдается2-кратное улучшение стереоселективности по сравнению с одиночным bF71L.Таблица 50. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов на основе bN388Q и bF71L в реакции ацилированияФА.ФА + R-MК амидФерментV0/E0, с-1 S/HESэ.и.50%ДТ1,00,12,8±0,157%bF71L4,4127±193%bN388Q0,30,12,7±0,246%bN388Q+bF71L3,80,8548±496%Интересным является факт, что в реакции ацилирования 2-АБ комбинация мутацийbN388Q и bF71L приводит к ухудшению стереоселективности по сравнению с одиночной139bF71L, а в реакции ацилирования ФА та же комбинация мутаций приводит к улучшениюстереоселективностипосравнениюсодиночнойbF71L,несмотрянаточтостереоселективность точечного мутанта bN388Q в обоих случаях практически не меняется.Таким образом мутация bN388Q в комбинации с bF71L может рассматриваться какфактор улучшения стереоселективности в реакции ацилирования ФА амидом R-МК.
Однако,следует принимать во внимание значительное ухудшение термостабильности.1403.9.4 Мутации bF256R, bA255RОстатки bA255 и bF256 располагаются на самойудаленнойотсеринаN-концевогостенкеучасткасвязывания амидной части субстрата и направлены враствор, в сторону, где находится карбоксильная группануклеофила(рисаминокислотногоАнализируя58).состававраспределениепозицииb256внутрисемейства ПА, следует отметить строгую гидрофобностьостатка (за исключением п/гр 3, представленной abПА),находящуюся в корреляции с позицией b71.Рисунок58.ВместеАцилфермент- остатки bF256, bF71, а также bL253 образуют единыйнуклеофильные комплексы ecПА протяженный сольватно доступный гидрофобный регионДТ (белый), bF256R (голубой) и на участке возможного связывания амидной частиbA255R (зеленый).
Структуры субстрата в ecПА (рис. 59), что несколько отличает ecПАполучены Строгановым О.В.от менее гидрофобизированной afПА.Замена остатков bA255 и bF256 на заряженныйаргинин может привести к появлению дополнительныхэлектростатическихкарбоксильнойулучшениювзаимодействийгруппысвязывания(рис.58),6-АПКи,ичтокакфиксацииприведеткследствие,Рисунок 59. Гидрофобноеувеличению β. Как видно из рисунка 58, в структурахокружение остатка bR256.ацилфермент-нуклеофильных комплексов, полученныхприпомощиметодовмолекулярнойдинамики,гуанидиновые группы аргинина в обоих мутантах и карбоксильная 6-АПК сближены, азначит есть возможность для формирования дополнительного взаимодействия, при этом дляостатка bR256 сохраняется π-стэкинг с остатком bF71, характерный исходно для пары bF256и bF71.В ходе работы нами были получены активные мутанты, содержащие вышеуказанныеаргининовые замены, а также ранее рассмотренные дополнительные замены bF71L, aS149R иbN388Q.
Однако, как оказалось, мутация bF256R приводит к 300-кратному увеличению141константы инактивации при 50°C (табл. 56), что, по всей видимости, отчасти можноприписать внесению заряженного остатка в исключительно неполярное окружение.Интереснымоказываетсятотфакт,чтодлядвойногомутантаbF256R+bF71Lтермостабильность улучшается в 5 раз по сравнению с bF256R, несмотря на то что одиночнаямутация bF71L приводит к ухудшению термостабильности.При изучении кинетических параметров гидролиза NIPAB были получены данные,представленные в таблице 51.Таблица 51.
Кинетические параметры гидролиза NIPAB для ПА ДТ и мутантов наоснове bF256R и bA255R.NIPABpH 7,5; 50°CФерментkcat, c-1KM, µM kcat/KMkin, мин-1ДТ28,0±0,623,1±0,81,26,0±1,0·10-3bF71L50±210±15,02,2±0,1·10-2bF256R13,7±0,427,0±0,80,51,8±0,2·10-1bF256R+bF71L18,4±0,97,2±0,62,63,9±0,5·10-2bA255R+bF71L52±25,4±0,59,72,8±0,3·10-2bF256R+aS149R23,7±0,767±20,41,5±0,1·10-1aR145G+bF256R0,60±0,0117±10,043,7±(0,5)·10-2bF256R+bN388Q+bF71L39,4±0,85,6±0,57,12,2±0,4·10-1Мутация bF256R при неизменности KM приводит к 2-кратному уменьшению kcat, посравнению с ecПА ДТ. Это обстоятельство имеет место и для пары bF71L и bF256R+bF71L.Интересным представляется факт, что мутация соседнего с bF256 остатка в мутантеbA255R+bF71L приводит, наоборот, к 2-кратному увеличению константы по сравнению содиночным bF71L и к 10-кратному по сравнению с ecПА ДТ.
В мутанте bF256R+bS149Rможно также зафиксировать 3-кратное уменьшение kcat/KM по сравнению с ecПА ДТ, однакоуменьшение в этом случае происходит за счет параметра KM. Этот факт весьма интересен в142силу того, что одиночная мутация bS149R представляется кинетически «нейтральной» (см.3.2.3.2). В мутанте bF256R+bN388Q+bF71L наблюдается увеличение kcat/KM по сравнению сbN388Q+bF71L, что также весьма неожиданно, в силу того, что bF256R во всех остальныхслучаях является «ухудшающей» заменой.Данные, полученные при изучении реакции синтеза ампициллина, представлены втаблице 52.Таблица 52.
Кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и мутантов на основеbF256R и bA255R.Ферментαβ, M-1γPmax *ДТ13±257±30,05±0,0126%bF256R42±5216±390,025±0,00932%bF71L7±140±30,30±0,03н.дbF256R+bF71L17±1289±280,020±0,005н.дbA255R+bF71L12±191±90,12±0,01н.дbF256R+aS149R33±4169±240,030±0,009н.дaR145G+bF256R 240±28 1340±120 0,008±0,002н.дaR145G29**423±190,002±0,001н.д* Максимальный выход при начальных условиях S0=N0=50 мМ. ** Данные работы [5].Почти 4-кратного улучшения параметра β можно достичь в случае мутации bF256R.При этом максимальный выход реакции при эквимолярном соотношении донора инуклеофила (50 мМ) составляет 32%, что на 6% превышает выход для ecПА ДТ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
