Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Условия реакции: pH 6,3, 25°C, 20 мМ 6-АПК, 50 мМ D-ФГ амид.Б: Зависимость скорости накопления продукта синтеза (сплошная) и гидролиза(пунктир) для есПА ДТ от концентрации 6-АПК.103Интерполируя зависимость соотношения S/H от концентрации нуклеофила (рис. 39)модифицированной гиперболической функцией:S/H [6 АПК ],1 [6 АПК ]нами были определены значения комплексных кинетических параметров – β и γ, которыепринято считать количественной характеристикой реакционной способности нуклеофила поотношению к данному ацилферменту.Рисунок 39. Нуклеофильная реакционная способность 6-АПК в реакции 1a для ecПАДТ и мутантов.Для полной характеристики исследуемого процесса по отношению начальныхскоростей гидролиза антибиотика и ацильного донора (рис. 40) определяли параметр α [39]:(k cat / K M ) Pk 4 K S 0P с0S 0N с0S (k cat / K M ) SK P k 2 0S с0P ( 0P 2 0N )с0P.104концентрация, М160x10-6140x10-6120x10-6100x10-680x10-660x10-640x10-6время, мин20x10-60204060Рисунок 40.
Начальные скорости накопления продуктов гидролиза ампициллина и DФГ амида, на примере bF256R+bF71L. Условия: 55 мМ D-ФГ амида, 2мМ ампициллина, pH6,3, 25°C. ○ D-ФГ, ● 6-АПК.Определенные таким образом комплексные кинетические параметры приведены втаблице 28.Таблица 28. Комплексные кинетические параметры в реакции 1а и 2э* для ecПА ДТ имутантов.ФерментДТОИS/Hαβ, M-1γ%1,0/1,0* 13±2/15,4* 54±6/159±63* 0,05±0,01/0,2±0,1* 26/27*bF71L0,77±140±30,30±0,03aS149R2,417±5158±300,04±0,03bN388Q1,014±1185±900,17±0,10bF256R3,442±5216±390,025±0,009bF24A13,3*0,4*,**367±33*0,07±0,01*aT68S+bS1T1,415±161±30,12±0,01***bA255R+bF71L1,212±191±90,12±0,01bF256R+bF71L4,417±1289±280,020±0,0053093*31105bN388Q+bF71L0,54,9±0,439±40,23±0,01bF24A+bF71L11,6*0,3±0,1*285±45*0,16±0,03*bF256R+bS149R3,033±4169±240,030±0,009bF24A+bF256R+bF71L>17*7,9±1,4*356±71*0,016±0,01*aR145G+bF256R5,6240±281340±1200,008±0,00267*78*% - максимальный выход антибиотика при эквимолярных (50мМ) условиях,** - данные [98], ***-см.
3.8.1.С целью изучения максимального выхода целевого антибиотика в условиях влияниявсех трех комплексных кинетических параметров нами были построены интегральныекинетические кривые накопления для ecПА ДТ и мутантов aS149R, bF256R, bF24A,bF256R+bF71L, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256R, показавших хорошие эффекты поотдельным параметрам (рис. 41).0,05aS149R: Выход 30%концентрация,М0,040,030,020,010,000100200300400500600время, минРисунок 41.
Интегральная кинетика реакции 1а для мутанта aS149R. Условияпроведения синтеза: 50 мМ 6-АПК, 50 мМ D-ФГ амида, pH 6,3, 25°C. ● – 6-АПК, ● – D-ФГамид, ● – Ампициллин, ● – ФГ.1063.5.2 Уточнение к вычислению параметра α.Как было указано в предыдущем разделе, параметр α можно экспериментальноопределять при совместном гидролизе двух субстратов по начальным скоростям накоплениянуклеофила 0N иацильной части 0P 2 .Однако же функция N (t )представляет собойотражение сложнейшего процесса, в результате которого нуклеофил как накапливается(EAN→EA, EAN→E), так и расходуется (EA→EAN). Моделирование процесса причисленном решении системы дифференциальных уравнений (см.приложение 3) показало, чтокривая накопления нуклеофила проходит как минимум через 3 перегиба (рис.42).
При этомдиапазон линейности начального участка, где соблюдается условие αэксп ≡ 0N с0S≥( 0P 2 0N )с0P0,95α оказывается очень мал и определяется начальными концентрациями реагентов (табл.29)Рисунок 42. Накопление нуклеофила при совместном гидролизе продукта (0,001 М) иацильного донора (0,01 М). По оси ординат концентрация нуклеофила (М), по оси абсциссвремя (с). Параметры модели α = 10, β = 1000, γ = 0,01.107Таблица 29.
Максимальная степень конверсии продукта, при которой достоверно(95%) определяется значение параметра αэксп, для различных начальных концентрацийисходных реагентов при совместном гидролизе.S0, МP0, М% конверсии по P1010,000047%10,10,047%0,10,010,47%0,010,0013,2%0,0010,00018,3%0,0001 0,000019,8%Параметры модели α = 10, β = 1000, γ = 0,01.Как видно из таблицы 29, чем ниже концентрация реагентов, тем для более высокойстепени конверсии можно проводить определение начальных скоростей. При установлениизависимости экспериментально определяемого значения параметра αэксп от концентрации(сознавая при этом, что сам параметр α от концентрации не зависит) была получена кривая(рис.
43), которая иллюстрирует нелинейное уменьшение параметра αэксп при увеличенииконцентрации. Также нами было показано, что значение параметра αэксп сильно зависит отприсутствия в системе солей. Так, например, включение в систему 10мМ ФБ более чем в 2раза сказывается на увеличении параметра αэксп.10865αэксп4321000,0020,0040,0060,0080,010,012P0, МРисунок 43. Влияние концентрации продукта (P0, ампициллин) на αэксп для ecПА ДТпри совместном гидролизе. Концентрация ацильного донора в каждой точке S0=10P0.Ориентиром для нахождения истинного значения параметра α служит величина,найденная для раздельного гидролиза, при обработке зависимости начальной скоростигидролиза (V0/E0) от концентрации субстрата (S0) в условиях S0<<KM.
(рис. 44), которая дляфермента ecПА ДТ составляет значение α=11±2.406-АПК35Vo/Eo мин-13025201510ФГ5000,000050,00010,00015So, M0,00020,00025Рисунок 44. Зависимость скорости реакции гидролиза ампициллина и ФГА отконцентрации субстрата для ecПА ДТ.109Величина αэксп =13±2 (таблица 28) для eПА ДТ случайным образом совпадает систинным значением α в силу того, что эксперимент проводили в присутствии 10мМ ФБ,который приводит к существенному завышению параметра. Поэтому данные α эксп из таблицы28 не могут рассматриваться как близкие к истинным значениям α, однако могут послужитьиллюстрацией для качественного сравнения мутантных форм.Таким образом, методика совместного гидролиза для определения истинного значенияпараметра α требует существенной доработки, однако, при проведении реакции в идентичныхусловиях может служить для быстрой качественной оценки эффекта от мутации.3.6 СтереоселективностьМутации в активном центре ecПА, изначально направленные на улучшениекаталитических свойств фермента в отношении одних субстратов, могут повлиять наспецифичность, а также стереоспецифичность фермента в отношении других субстратов.
Сампо себе дизайн мутантов, с целью одновременного улучшения связывания (KM) одногоэнантиомера и ухудшения или неизменности связывания другого, представляет собойдовольно не тривиальную задачу. Еще сложнее предсказывать изменение каталитическойконстанты (kcat). Поэтому эмпирический скрининг библиотеки мутантов представляется поканаиболее доступным подходом к инженерии стереоспецифичности фермента в отношении кконкретным соединениям.Известно, что стереоселективность ecПА в реакциях ацилирования аминокислот игидролиза их N-ацильных производных достаточно высока, что с успехом можетиспользоваться при получении их в энантиомерно чистой форме. Однако для аминоспиртовзначение стереоселективности на порядки ниже и улучшение этого параметра для данногокласса соединений представляет большой практический интерес [55].В рамках данной работы нами была изучена стереоселективность мутантов ПА вреакцияхацилированияфенилаланинола(ФА),алифатическогоатакже2-аминобутанолагидролиза(2-АБ)иN-фенилацетильногоароматическогопроизводногофенилаланинола (ФФА).
На практике 2-АБ используется как промежуточное соединение всинтезе противотоберкулезного препарата Этамбутола [120], а также может выполнять рольхирального агента для разделения рацематов, например, при получении оптически чистогопредшественника гипотензивного препарата Каптоприла [121]. Различные производные110энантиомеров ФА могут применяться при лечении центральной нервной системы [122],специфических воспалений [123] и также выполнять роль хиральных агентов [124].Реакцию ацилирования (L,D)-2-АБ проводили с двумя донорами ацильной части –амидами (R)- и (S)-МК:OHOHNH2ПАOH+OOH+OpH 9.0NH2амид (R)- или (S)-МКHNNH2OH(R)- или (S)-манделил-L-2-АБ(D,L)-2-АБ(D)-2-АБРеакцию ацилирования (L,D)-ФА проводили с амидом (R)-МК:OHOHNH2*Oамид (R)-МК*+OH ПАNH2+OpH=9(R,S)-фенилаланинолNH*OH(R)-манделил-S-фенилаланинолOHNH2(R)-фенилаланинолСтереоселективность определяли как отношение начальных скоростей синтеза Nманделил-производных, соответствующих (L)- и (D)-формам (рис. 45).концентрация, М200x10-6180x10-6160x10-6140x10-6120x10-6100x10-680x10-660x10-640x10-620x10-6время, мин00102030Рисунок 45.
Ацилирование рацемата 2-АБ амидом R-МК на примере мутантаbF256R+bF71L ● – МК, ● – N-манделил-(L)-2-АБ, ● - N-манделил-(D)-2-АБ.111Также по отношению суммарных начальных скоростей синтеза N-манделилпроизводных и гидролиза ацильного донора с образованием МК определяли значенияпараметра S/H.Стереоселективность в реакции гидролиза ФФА определяли по отношению начальныхскоростей накопления (D)- и (L)-фенилаланинола:NHHNПАH2N+O(R,S)-ФФАOHpH 7.5OOH(L)-ФФАOH(D)-фенилаланинолКонцентрацию образующихся при гидролизе свободных аминогрупп определялипосле предварительной модификации реакционной смеси хиральным тиолом – N-манделил(S)-цистеином и о-фталевым альдегидом (схема 5), как это описано в [125].Схема 5. Модификация первичных аминогрупп о-фталевым альдегидом и хиральнымтиолом.Полученные результаты представлены в таблицах 30-33:112Таблица 30. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов в реакции ацилирования 2-АБ амидом R-МК илиэфиром D-ФГ.2-АБ +R-MК амид (D-ФГ эфир*)ФерментV0/E0, с-1ДТ0,4/0,7*bS1T+bT68S0,70,0210±182%bT68S0,010,053,0±0,249%bF24A0,8*0,02*20±1*90%*bF24A+bF71L13,8*0,2*6,1±0,4*72%*bF24A+bF71L+bF256R3,4*0,1*3,2±0,3*52%*bF71L1,90,354±1596%bF71A0,40,180±1798%aS149R0,20,038±177%bN388Q0,60,0319±490%bN388Q+bF71L3,10,2837±795%bF256R0,30,0617±389%bF256R+bF71L0,60,54111±898%bA255R+bF71L2,00,2682±798%bF256R+aS149R0,040,0412±285%bF256R+bN388Q+bF71L0,80,34160±(10)99%aR145G+bF256R0,20,1335±694%S/HESэ.и.50%0,02/0,02* 12±1/3,7±0,6* 84%/57%*113Таблица 31.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов в реакции ацилирования 2-АБ амидом S-МК.2-АБ +S-MК амидФерментV0/E0, с-1S/HESэ.и.50%ДТ0,30,052,3±0,139%bF71L0,10,161,7±0,2(R)26%aS149R0,10,035,1±0,567%bN388Q+bF71L0,050,51,6±0,1(R)23%bF256R0,040,061,6±0,223%bF256R+bF71L0,021,21,3±0,2(R)13%Таблица 32. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов в реакции ацилирования ФА амидом R-МК илиэфиром D-ФГ.ФА +R-MК амид (D-ФГ эфир*)ФерментV0/E0, с-1S/HESэ.и.50%ДТ1,0/2,2*0,1/0,2*2,8±0,1/1,2±0,1*47%/9%*bS1T+bT68S1,20,13,1±0,251%bT68S0,010,053,0±0,249%bF24A5,8*0,15*4,6±0,4*64%*bF24A+bF71L34,2*0,47*6,0±0,1(R)*71%*bF24A+bF71L+bF256R2*0,08*1,8±0,1(R)*29%*114bF71L4,34127±193%bF71A*1,41700±30099,7%aS149R0,30,12,6±0,444%bN388Q0,30,12,7±0,246%bN388Q+bF71L3,80,8548±496%bF256R0,10,078±178%bF256R+bF71L0,10,120±290%bA255R+bF71L4,00,959±997%Таблица 33.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
