Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Для визуализации полос белка отделенный от стеколгель помещали на 30 мин в раствор 5 (0,3 % Кумасси R250, 1 CH3COOH:3 C2H5OH:6 H20) приперемешивании. Для отмывки использовали горячие растворы 6 (50% C2H5OH, 10%CH3COOH) и 7 (7% CH3COOH, 5%C2H5OH). Раствор 7 можно использовать для хранениягелей. Чувствительность окраски с помощью Кумасси R250 составляет 1 мкг белка в полосе.Нативный электрофорез проводили в аналогичных условиях при полном отсутствии SDSво всех компонентах системы, без добавления βМЭ, а также без последующего нагреванияпробы.782.2.8 СеквенированиеСеквенирование проводили на секвенаторе Applied Biosystems 3730 XL DNA Analyzer(сервис компании «Евроген»).
Чтению подвергался участок 700-900 п.н. (регулярнополучаемая дальность прочтения 500-600 нуклеотидов), содержащий вводимую мутацию.2.2.9 Титрование активных центровАбсолютную концентрацию активных центров полученных мутантов ПА определялититрованием препарата фермента необратимым ингибитором ФМСФ, как описано ранее [58].К препаратам пенициллинацилазы добавляли свежеприготовленный водный раствор ФМСФопределенной концентрации. Смесь инкубировали в 10 мМ фосфатном буфере (pH 6,5) втечение 10 минут.
Остаточную активность определяли в реакции гидролиза цветногосубстрата NIPAB (1·10-4М ≈ 4KM для ПА E.Сoli) в 0.1М фосфатном буфере (pH 7,5; 25°С).Операцию повторяли 7÷12 раз до полной инактивации фермента. Концентрацию активныхцентров пенициллинацилазы в препарате определяли из линейной регрессии как значениеконцентрации ингибитора в инкубационном растворе, при которой достигается полнаяпотеря ферментативной активности.2.2.10 Определение кинетических параметров гидролиза цветного субстратаАктивность фермента определяли на спектрофотометре по поглощению окрашенногопродукта реакции гидролиза NIPAB на длине волны 400 нм.
Кинетические параметрыгидролиза NIPAB, катализируемого нативной и мутантными ПА, определяли при анализезависимости начальных скоростей гидролиза от концентрации субстрата в кинетическомбуфере (0,01 М ФБ, 0,1 М KCl, pH 7,5) при 25°С. Результаты серии 8-10 измерений начальнойскорости при концентрациях субстрата в интервале 1·10-5÷2·10-4М обрабатывали методомрегрессионного анализа в прямых координатах функцией V0=kkat·S0·E0/(KM+S0).2.2.11 Изучение pH- и термостабильностиТермоинактивацию мутантов ПА и нативного фермента исследовали при 50°С и pH7,5 (в некоторых случаях при pH 7,0) в 0,01 М фосфатном буфере (в некоторых случаяхзначение ионной силы поддерживалось внесением 0,1 М KCl).
Щелочную стабильностьопределяли в 0,01 М боратном буфере с pH 10,0 при добавлении 0,1 М KCl, а также в 0,179CAPS буфере при pH 11,0. Кислотную стабильность определяли в 0,1 М ацетатном буфере сpH 4,0. Раствор фермента в концентрации 1-10·10-7 М инкубировали в термостатируемойванне термостата. Через определенные промежутки времени отбирали 20 мкл. раствора ипроводили спектрофотометрическое измерение остаточной активности, как описано выше.Значения константы инактивации (kin) рассчитывали при интерполяции полученнойзависимости приведенной остаточной активности (A/A0) от времени инкубирования (t)функцией A/A0=exp(-kin·t), соответствующей первому порядку реакции.2.2.12 Ингибиторный анализПри проведении ингибиторного анализа измеряли приближенное значение kkat/KM кактангенс угла наклона зависимости скорости гидролиза NIPAB от концентрации субстрата.Значение скорости определяли для трех концентраций, соотвествующих 0,1 KM – 0,3 KM дляNIPAB.
Подобные измерения проводили для трех концентраций ингибитора, причемконцентрацию ингибитора подбирали таким образом, чтобы можно было зафиксироватьуменьшение kkat/KM не менее чем в 2 раза. Измерение скорости гидролиза NIPAB проводили всоответствии с 2.2.9.2.2.13 Определение параметра S/HВ отдельной емкости (обычно фалькон на 15-50 мл) смешивали навески сухихпрепаратов 6-АПК и донора ацильной части (D-ФГА, п-OH-D-ФГА, D-ФГМ, п-OH-D-ФГМ) вэквимолярном соотношении в концентрации 50 мМ, если не указано иное. Добавлялиприблизительно 9/10 требуемого объема H2O дист. Доводили pH 6,3.
Затем добавлялиостаток H2O дист. с учетом последующего разбавления за счет внесения фермента. 1,9 млсмеси переносили в термостатируемую ячейку (30°С). Реакцию начинали внесением 100 мклфермента (обычно в концентрации 5,0·10-7 М). pH поддерживали раствором NaOH c заранееподобранной концентрацией при постоянном перемешивании. По ходу синтеза отбиралиаликвоты 20 мкл, останавливая реакцию добавлением CH3СN. Далее разбавлялиреакционную смесь элюентом и проводили ВЭЖХ анализ. Реакцию проводили до степенейпревращения не более 10% по ацильному донору.По отношению начальных скоростей накопления продукта синтеза (целевогоантибиотика) и непродуктивного гидролиза (D-ФГ или п-OH-D-ФГ) определяли параметрS/H.802.2.14 Определение параметров β и γРеакцию синтеза антибиотика проводили аналогично 2.2.13. При фиксированнойконцентрации ацильного донора варьировали содержание 6-АПК в системе в диапазоне от 30до 200 мМ.
Для каждой концентрации 6-АПК определяли отношение начальных скоростейсинтеза антибиотика и непродуктивного гидролиза (S/H). Далее, интерполировалиполученные зависимости S/H от концентрации 6-АПК модифицированной гиперболическойфункцией S/H=β·[6-АПК]/(1+β·γ·[6-АПК]) и находили параметры β и γ.2.2.15 Определение параметра αПри совместном гидролизе реакции проводили аналогично 2.2.13.
В качествеисходных компонентов брали растворы антибиотика (ампициллин, амоксициллин) иацильного донора (D-ФГА, п-OH-D-ФГА, D-ФГМ, п-OH-D-ФГМ). pH 6,3 поддерживали припомощи 10мМ ФБ. Концентрации реагентов подбирали для каждого мутанта отдельно в ходепредварительного эксперимента таким образом, чтобы начальные скорости накопленияпродуктов гидролиза в основном эксперименте были сопоставимы. Для системы DФГА/ампициллин начальные концентрации составляли величину 1 мМ/0,1 мМ. Степеньнакопленияпродуктовспецифичностиαгидролизаопределялипонепревышалаотношению10%.начальныхПараметротносительнойскоростейнакоплениясоответствующих продуктов гидролиза в пересчете на исходные концентрации реагентов.См. также раздел 3.5.2.При раздельном гидролизе реакции проводили в отдельных ячейках.
Температура(30°С), концентрация фермента (1,0·10-8 М), концентрация реагентов (5,0·10-4 М) впараллельных экспериментах была одинаковой. Параметр α определяли по отношениюначальных скоростей гидролиза антибиотика и ацильного донора.2.2.16 Определение максимального выхода реакцииВ термостатируемой ячейке смешивали сухие препараты 6-АПК (0,05 М) и ацильногодонора (0,05 М). Фермент добавляли до концентрации 2,0·10-6 М. Аликвоты по 20 мклотбирали в течение 2-4 часов.
Реакцию останавливали не менее чем через 1 час последостижения максимальной концентрации антибиотика (ВЭЖХ контроль).812.2.17 Определение стереоселективности в реакции ацилирования 2-аминобутанола ифенилаланинолаДля реакции ферментативного ацилирования смешивали рацемат 2-АБ или ФА идонор ацильной части (S-МК или R-МК амиды) в концентрации 50 мМ в общем объеме 2 мл,доводили pH 9 раствором NaOH и вносили фермент в концентрации 5·10-7 М. Реакциюпроводили в термостатируемой ячейке (25°C) при постоянном перемешивании, поддерживаяpH в ходе реакции. Аликвоты 20 мкл отбирали в течение 60-90 мин.
Степень превращенияпри этом не превышала 10%. Затем, останавливали реакцию в ацетонитриле, выполнялисерию разбавлений и анализировали на ВЭЖХ.Стереоселективность (E) определяли как отношение начальных скоростей синтеза Nманделилов R- и S-2-АБ или ФА. Параметр S/H определяли по отношению начальныхскоростей суммарного накопления продуктов переноса и миндальной кислоты.2.2.18 Определение стереоселективности в реакции гидролизафенилацетилфенилаланинолаРеакцию ферментативного гидролиза 50 мМ рацемата N-фенилацетилфенилаланинолапроводили в общем объеме 2 мл при добавлении фермента до концентрации 5·10-7 M.Реакционную смесь выдерживали в термостатируемой ячейке (25°C) при постоянномперемешивании, поддерживая pH 8,0.
Аликвоты по 100 мкл отбирали в течение 60-100 мин.Останавливали реакцию в 200 мкл ацетонитрила. Степень превращения не превышала 10%.Полученные 300 мкл реакционной смести разделяли на две равные части. Первуючасть без разбавления анализировали на системе ВЭЖХ 2, с целью слежения за накоплениемФУК для определения начальной скорости ферментативного гидролиза. Для предколоночноймодификации свободных аминогрупп, с целью слежения за накоплением образующихсяотдельных энантиомеров фенилаланинола, ко второй части реакционной смеси добавляли100 мкл о-фталиевого альдегида (20 мМ) и 100 мкл хирального тиола R-NMC (60 мМ), атакже 650 мкл 0,2 М боратного буфера (pH 9,0).
Смесь выдерживали в течение не менее 15минут и анализировали образующиеся диастириомерные изоиндолы на ахиральнойстационарной фазе системы ВЭЖХ 1. Из полученных хроматограмм вычисляли отношениеплощадей изоиндолов, соответствующих R- и S-ФА. При помощи материального баланса по82накоплению ацильной (ФУК) и амидной части (R- и S-фенилаланинол) приводили отношенияплощадей к действующим концентрациям энантиомеров в системе.Стереоселективность определяли как отношение начальных скоростей накопления Rи S-фенилаланинола. Параметр S/H определяли по отношению начальных скоростейсуммарного накопления фенилаланинола и ФУК.2.2.19 ВЭЖХДляопределениядействующихконцентрацийреакционныхкомпонентовиспользовали ВЭЖХ систему Perkin Elmer 200 Series с колонкой для обращенно-фазовойхроматографии Phenomenex Luna 5u C-18 250·4,6 мм (ВЭЖХ 1, если не указано иное, *) исистему Милихром A-02 с колонкой Phenomenex Luna 3u C-18 50·3мм (ВЭЖХ 2). Аликвотыреакционной смеси переносили в элюент, разбавляли до концентрации порядка 1·10 -4 М ианализировали.
Параметры ВЭЖХ анализа и время элюирования приведены в таблице 23.Таблица 23. Параметры ВЭЖХ анализа и время элюирования компонентовреакционных смесей.Синтез/гидролиз ампициллинаВЭЖХ 1элюент: 0,68 г/л KH2PO4, 0,1 г/л SDS, pH 3,0, 28% CH3CNскорость потока: 0,5 мл/миндетектирование: 210 нмКомпоненты:Время удерживания (мин):ФГ7,26-АПК9,2D-ФГА19,6Ампициллин28,583Ацилирование R- и S-2-аминобутанолаВЭЖХ 1колонка*: Kromasil Eternity-5-C18, 4,6*250нмэлюент: 0,68 г/л KH2PO4, 0,2 г/л SDS, pH 3,0, 20% CH3CNскорость потока: 1 мл/миндетектирование: 210 нмКомпоненты:Время удерживания (мин):Амид миндальной кислоты3,8Миндальная кислота4,6S-манделил-S-2-аминобутанол5,5R-манделил-R-2-аминобутанол5,5S-манделил-R-2-аминобутанол6,9R-манделил-S-2-аминобутанол6,9Гидролиз R-и S-N-фенилацетилфенилаланинолаВЭЖХ 1элюент: 0,68 г/л KH2PO4, pH 6,8, 29% CH3CNскорость потока: 0,5 мл/миндетектирование: 340 нмтермостатирование: 45°СКомпоненты:изоиндольное производное S-фенилаланинолаВремя удерживания (мин):3684изоиндольное производное R-фенилаланинола38ВЭЖХ 2элюент: 0,68 г/л KH2PO4, pH 3,0, градиент 0-80% CH3CNскорость потока: 0,2 мл/миндетектирование: 210 нмКомпоненты:Время удерживания (мин):ФУК7,6R- и S- фенилацетилфенилаланинол9,3*Также нами была протестированы другие условия для системы ВЭЖХ 1: колонка -Kromasil eternity 2,5u, C18, 4,6·100мм, элюент - 57% (CH3CN/H2O = 50/50, 0,2 г/л SDS), 43%(0,68 г/л ФБ, 0,2 г/л SDS pH 3,0), поток – 1 мл/мин , что позволило минимум вдвое сократитьвремя анализа.Для обработки экспериментальных данных использовали программное обеспечениеTotalChrom (PerkinElmer, США) и Милихром (Россия).2.2.20 Компьютерное моделированиеНа основании численного решения задачи Коши методом Гира для схемы 1 в пакетематематических программ Maple 8 (Maplesoft) была построена математическая модельреакции ацильного переноса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
