Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Энантиомерный избыток и другие характеристики в реакции синтеза R- иS-ампициллина из 90мМ метилового эфира rac-ФГ и 20 мМ 6-АПК.э.и.(R)э.и.(S)Сумм.вых. %ОИ катДТ37%-30,71bF24A*98%-42,80,61bF24S97%-35,50,027bF24P95%-27,20,13bF24G70%-17,70,06aF146A-51%13,50,28aF146Q-57%13,20,05aF146R-65%10,40,03aF146Y-36%5,10,05*Мутант bF24A не был обнаружен в результате скрининга библиотек, но был полученотдельно.Исходя из представленных данных, можно сделать вывод, что мутации по остаткуbF24 приводят к улучшению стереоселективности по отношению к R-энантиомеру, чтосогласуетсясрезультатамиработы[99],апоостаткуaF146кулучшениюстереоселективности по отношению к S-энантиомеру.
Данный вывод находится всоответствии с данными РСА (1k7d), где показано, что остаток bF24 находится с однойстороны Сα-CH3-группы, а aF146 с противоположной. Авторами также продемострированызаметные улучшения синтетических способностей мутантов на основании замен по остаткуbF24 в реакции 1э (ОИконв до 86/38, ОИS/H до 4,2). Впервые в данной работе была обнаруженарацемазная активность ПА. Так, например, при проведении синтеза ампициллина,катализируемого мутантом bF24A, при использовании метилового эфира S-ФГ наблюдаетсянакопление 8% R-ампициллина (рис.26).61Рисунок 26. Синтез ампициллина из 20мМ 6-АПК и 60мМ метилового эфира S-ФГ,катализирумый мутантом bF24A.Принимая во внимание ценность полученных результатов, следует, однако, отметить,что только для двух мутантов наблюдается сохранение достаточного уровня каталитическойактивности.
При этом для наиболее перспективного R-активного bF24A не представляетсявозможным использовать традиционный ФГА в качестве ацильного донора, в связи с потерейферментом амидазной активности.CASTС целью улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы PAS2 в работе [76]проводили комбинированный сайт-насыщающий мутагенез сразу по трем остаткам aR160,aF161, bF24, соответствующим остаткам aR145, aF146, bF24 в активном центре ecПА.
Былаполучена и проскринирована на ВЭЖХ библиотека из 700 мутантов (рис.27).Рисунок 27. Скрининг мутантов PAS2. Клоны, обведенные овалом – наилучшиеотобранные мутанты; клоны, закрашенные черным подвергали повторному скринингу(периплазматические экстракты).62При этом были отобраны комбинации мутаций, которые привели к улучшениюпараметров S/H, α, β, γ в реакциях 1а/э и 3а/э и значительному увеличению выхода вреакциях 1э и 3э (табл.19 и 20).Таблица 19. Отобранные в ходе скрининга мутанты.НазваниеМутацииTM23aR160K+aF161L+bF24ATM26aR160Q+aF161L+BF24QTM33aR160R+aF161F+bF24ATM38aR160P+aF161A+BF24VTM42aR160Q+aF161R+BF24ITM48aR160P+aF161A+bF24QТаблица 20.
Параметры в реакциях 1а/э и 3а/э для PAS2 ДТ и отобранных мутантов.ФерментPAS2 ДТTM23TM33TM38Ац. донорРеакция 1Реакция 3αβ0, мМ-11/γαβ0, мМ-11/γамид13,20,567,30,559эфир16,40,569,10,559амид2186,336458,818,469эфир8,86,33642,418,469амид20910,228688,821,5154эфир11,610,22864,921,5154амид2004,916757,221,158эфир7,64,91672,221,158По скорости превращений в реакциях с амидами мутантные ПА все же уступаютродительской PAS2, что, вероятно, связано с наличием мутации по остатку bF24.
Такжевысокие значения параметра α в случае амидов не позволяют использовать традиционный DФГА в качестве ацильного донора. Стоит отметить, что при оценке эффективности синтезаавторы использовали упрощенный параметр β0, полученный на основании лишь начальногоучастка зависимости S/H от концентрации нуклеофила, а параметр 1/γ определялся с63помощью математематических построений при использовании шести экспериментальныхпараметров, что вряд ли заслуживает должного внимания.Подобная стратегия была также реализована в работе [89] для bmПА (30%идентичности ecПА), для которой с помощью комбинированного мутагенеза были полученыодиночные и двойные мутанты по остаткам aR144, aF145, bF24, что привело к 3-кратномуулучшению параметра S/H в реакции 3а по сравнению с родительской bmПА.
Однако,показатели характерные для ecПА остались недостижимы.Консенсусный подходВработе[105]авторыразработалиновыйподходдлясозданияболеетермостабильной ecПА. Для этого на первом этапе проводилось выравнивание первичныхпоследовательностей a- и b-субъединиц восьми известных ПА класса IIa. Были найдены 109из 766 возможных остатков в ecПА, которые, с одной стороны, были отличны поаминокислотному составу от соответствующих остатков в ecПА и, с другой стороны,встречались в более чем 50% остальных последовательностей (консенсусный подход).
Длясужения полученной библиотеки выбирались замены, соответствующие следующимкритериям: (i) чтобы снизить возможность влияния на активность, мутация должнанаходиться на расстоянии не менее чем 10Å от активного центра, (ii) если мутациянаходится в спирали, то она не должна вызывать дестабилизирующего эффекта, (iii)существующие водородные связи и солевые мостики остаются нетронутыми, (iv)исключаются из рассмотрения стабилизирующие мутации уже описанные в литературе. Врезультате было предложено 20 мутаций, что составляет всего лишь 3% остатков зрелогобелка (табл. 21).64Таблица 21. Термостабильность мутантов предложенных в работе [105].МутацияВторичная структура Расстояние до а.ц. (A) ТермостабильностьaW25YH31,2+aA80RH29,9+aM90RH29,5=aQ118EH22,6н.а.aT121DH27,7-aE130TU27,9н.а.aT150NU15,5+bS9ET21,9н.а.bA84PB42,2+bV97KB37,2н.а.bL100EB32,6+bA149QH20,1н.а..bV184KT22,7-bA305DH29,9+bT311P/Q312AU/T38,2/36,9+bN348DH18,3+bV359LH19,4+bS374TU/T15,6=bV400LT20,8+bA545KH32,1-H - альфа-спираль, В - бета тяж, T - поворот, U - бесструктурный элемент;+ повышенная термостабильность, - пониженная, = эквивалентная.Такимобразом,средиполученныхмутантов10обладалиповышеннойтермостабильностью, 4 - пониженной, 2 - эквивалентной, а оставшиеся 7 характеризовалисьслишком низкой активностью.
Улучшение времени полуинактивации (t1/2) составило от 1.2до 3 раз. Для сопоставления экспериментальных данных с возможными теоретическимипредсказаниями были испытаны программы «I-Mutant», «Fold-X», «PROSA 2003» и«SCRATCH», однако, не было найдено сколько-нибудь удовлетворительного соответствия.65Столь высокий успех (50%) предложенных мутаций гораздо выше, чем возможный успех прииспользовании методик случайного мутагенеза, при этом данный подход не требует знаний омеханизме инактивации ПА. Однако, возможно, именно детальное понимание механизматермоинактивации в будущем может привести к существенно более стабильным вариантам.Интересным продолжением исследования, на наш взгляд, было бы объединение полученныхмутаций и определение аддитивных комбинаций.1.2.2.4 Расширение возможностей белковой инженерииПри всем многообразии подходов к улучшению технологических показателейпроцесса следует отметить возможность их совместного использования.
При этом можноожидать не только аддитивности, но и синергизма эффектов. Так комбинациейвзаимодополняющих подходов белковой инженерии и иммобилизации можно улучшитьколичественные показатели в реакциях синтеза бета-лактамных антибиотиков. В работах[106; 107] за счет удлинения b-цепи ecПА на 6 остатков в мутанте 3G3K и иммобилизациина глиоксильной подложке удалось в несколько раз улучшить S/H в реакциях ацилированияпроизводных 7-АЦК. Эффект, предположительно, обусловлен увеличением трансферазнойактивности за счет улучшения доступности активного центра для нуклеофила, чтодополнительно фиксируется при помощи иммобилизации. Данный пример иллюстрирует,что весьма удаленные от активного центра поверхностные остатки также могут влиять накаталитическую активность фермента.
Однако, к сожалению, авторы в своей работеограничиваются лишь эфирами, искусственно подавляя спонтанный гидролиз за счетуменьшения температуры до 4°С, что, на наш взгляд, вряд ли сможет найти применение впромышленной технологии.В работе [108] авторы провели иммобилизацию мутантов bF24A и bF24A+aF146Y наглиоксильной подложке Eupergit C250L и добились высоких степеней превращения вреакциях 3э, 10э, 11э (табл. 22.).66Таблица 22. Скорость и максимальный выход ферментативного синтеза беталактамных антибиотиков, катализируемого иммобилизованными ecПА ДТ и мутантами приразличных температурах.ФерментДТРеакция T(°C) VS (мкМ/мин) Выход (%)3а284,467bF24A280,168bF24A+aF146Y280,37740,490283,77640,399281,99840,8992849940,4842826540,198281,59840,599283,799280,259bF24A280,598bF24A+aF146Y280,699ДТ3эbF24AbF24A+aF146YДТ9эbF24AbF24A+aF146YДТ10эКак видно из таблицы, в случае традиционных амидов эффект значительно менеевыражен и компенсируется многократным снижением активности.При комбинации «направленной эволюции» с фаговым дисплеем [109], можносущественно расширить возможности первой, которую становится возможным проводить invitro при использовании более широкого круга субстратов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
