Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Каталитический механизм с участием N-концевого серина [61]. На рисункепредставлены 1- свободный фермент, 2 - тетраэдрический интермедиат, 3 - ацилфермент.Показаны также два возможных пути превращения ацилфермента: деацилирование, сучастием воды, и ацилирование, с участием нуклеофила (Nu:).281.1.3.4 Конформационные переходы в активном центре.В работах [62; 63] был проведен РСА комплексов ecПА с различными лигандами.Сравнение карт электронной плотности фермент-лигандных комплексов и исходного белкасвидетельствовало о том, что пространственное расположение аминокислотных остатков ПАв свободной форме и в комплексе с рассмотренными ингибиторами мало отличается (впределах 0.2Å), за исключением области активного центра, находящейся в сфере с радиусом15Å.
Таким образом, при связывании некоторых лигандов происходят конформационныеизменения в активном центре ПА, и, в зависимости от структуры лиганда, двааминокислотных остатка - aF146 и aR145 - могут находиться в двух энергетически выгодныхпространственных положениях – в «закрытой» конформации, где гуанидиновая группаостатка aR145 связана с карбонильным кислородом остатка bF24 и гидроксильнымкислородом bY31, и в «открытой» конформации, где боковой радикал аргинина повернут враствор (рис.9).aF146aN144aR145Рисунок 9. Конформации боковых радикалов остатков aR145 и aF146 в открытом(показано красным цветом) и закрытом (показано зеленым цветом) положениях.Представлено наложение спирального региона a140-a148.
Точками изображены позиции Cαатомов в доступных рентгеновских структурах ПА и ее комплексов с различными лигандами.В теоретической работе [64] было показано, что смещение боковых цепей остатковaR145 и aF146 является лишь частью сложных структурных перестроек в активном центрефермента (рис.10).29Рисунок 10. Закрытая (А) и открытая (Б) конформации ecПА.Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на связывание субстратовобусловлено тем, что остаток aF146 образует одну из стенок «гидрофобного кармана». Взакрытой конформации фермента горлышко гидрофобного кармана слишком узко, чтобыпозволить связаться ацильной части субстрата, однако при переходе фермента в открытуюконформацию и смещении бокового радикала остатка aF146 главный диаметр увеличиваетсядо 9Å, что достаточно для проникновения субстрата в гидрофобный карман.Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на каталитическиесвойства фермента связано с системой конформационных переходов остатков aN148, aS149,bF71 и bN241.
Конформационный переход освобождает дополнительное место для боковогорадикала bF71, который смещается как целое, плотно прижимаясь к спирали, что приводит кувеличению сольватно-доступной площади остатка bN241, и, как следствие, дестабилизацииоксианионного центра [64].Таким образом, в открытой конформации облегчено проникновение субстрата вактивный центр, а в закрытой облегчен катализ как за счет лучшего связывания, так и за счетблагоприятной геометрии.301.1.3.5 Участок связывания ацильной части.Аминокислотные остатки активного центра, отвечающие за связывание ацильнойчасти субстрата и, следовательно, определяющие субстратную специфичность фермента,были установлены из РСА комплекса пенициллинацилазы с ФУК (1pnl, рис.11) [16].bR263bR263bN241bF71bN241bF71bS1bI177bA69PAAbS1bI177bA69PAAbP22bP22bQ23bQ23bF57aF146aR145bF24bY31bF57aF146aR145bF24bY31Рисунок 11.
Строение гидрофобного кармана пенициллинацилазы по данным РСА(стереоизображение). Гидрофобные остатки, участвующие в связывании субстрата, показаныжелтым цветом. Остатки, непосредственно участвующие в катализе (bS1, bA69, bN241)обозначены зеленым цветом. Положительно заряженные остатки (bR263 и aR145) выделеныкрасным.Было показано, что определяющую роль в связывании играют гидрофобные остатки,принадлежащие как a-, так и b-цепи.
Стерически ограниченная гидрофобная полость всвободном состоянии имеет термодинамически невыгодный контакт с окружающей средой, ив результате гидрофобного взаимодействия субстрата с ферментом имеет место двойнойвыигрыш в энергии, складывающийся из энергии переноса гидрофобного субстрата из воды вгидрофобную полость фермента и выигрыша энергии за счет вытеснения воды из активногоцентра [28].31Так, гидрофобные взаимодействия существуют между бензольными кольцами ФУК иbF24, которые располагаются параллельно друг другу. aF146 находится на противоположнойстороне гидрофобного кармана.
Он также взаимодействует с ФУК, и при этом экранируетактивный центр от растворителя. Еще один фенилаланин, bF57, локализован на дне полости.Наименьшее расстояние между ним и ингибитором составляет 4.7 Å, что слишком много дляпрямого взаимодействия. Однако этот остаток может быть важен для поддержания структурысайта связывания, поскольку отстоит на 3.5 Å от bP22 и на 3.9 Å от bF24, которыенепосредственно участвуют в связывании субстрата. Также в гидрофобном карманеприсутствуют такие неполярные аминокислотные остатки, как bI177 и aM142.1.1.3.6 Участок связывания амидной части.При анализе рентгеноструктурных данных по комплексу пенициллина с неактивныммутантом bN241A (1fxv) [65], становится ясно, что Пен-G на первом этапе связывается воткрытой конформации, что позволяет объемной амидной части субстрата уместиться вактивном центре фермента.
В открытой конформации фенильное кольцо остатка bF71оказывается в плоскости параллельной бета-лактамному кольцу. Более того, появляются Вандер-Ваальсовы взаимодействия между метильной группой Пен-G и С1 атомом aF146, чтотакже усиливает связывание.Комплекс нативного фермента с «медленным» субстратом сульфоксидом Пен-Gпредставляет собой фермент-субстратный комплекс непосредственно перед каталитическимактом (1gm9) [63]. Позиции остатков aR145 и aF146 в данном случае соответствуют закрытойконформации, а амидная группа bN241 образует водородную связь с карбонильнымкислородом субстрата.
При этом бета-лактамное кольцо сдвигается на 3.5Å по направлению костатку bR263, который, наряду с bN388, взаимодействует с карбоксильной группойсубстрата (рис.12).32Рисунок 12. Наложение структур комплексов Пен-G в открытой конформации (1fxv,зеленый) и сульфоксида Пен-G в закрытой конформации (1gm9, красный) в районе активногоцентра.В ходе исследования структуры фермент-субстратных комплексов с Пен-G методамимолекулярной динамики [64] было показано, что в связывании амидной части субстратазаметную роль играет также остаток bS386, который образует водородную связь скарбонильным кислородом четырехчленного цикла, а также положительно заряженныйостаток aR145, взаимодействующий с карбоксильной группой субстрата опосредованно черезмостиковые молекулы воды.Мутационный анализ остатков aR145 и bR263 показал, что оба остатка существенныдля катализа, а bR263 необходим также для автокаталитического созревания [66].
ИзучениеpH профилей активности мутантов по этим остаткам говорит о существенной ролиположительногозарядагуанидиновойгруппы.Такжеполученныеструктурныеикинетические данные показывают, что bR263, положительный заряд которого увеличиваетполярность оксианионного центра, принимает участие во всем каталитическом цикле (см.раздел 1.1.3.3). Следует отметить, что как bR263, так и aR145 консервативны и присутствуютв ПА из почти всех известных источников.Помимо описанного продуктивного связывания субстратов в активном центре ПА вработе [67] с помощью методов молекулярного докинга и молекулярной динамики удалосьобнаружитьдвадополнительныхрежимасвязывания–предпродуктивныйинепродуктивный, которые характеризуются сравнимыми с продуктивным состоянием33энергиями связывания.
Уникальным свойством предпродуктивных и непродуктивныхкомплексов является то, что ацильная группа субстрата не попадает в гидрофобный карман, аадсорбируется на участке активного центра между остатками bR263 и aR145.1.1.3.7 Локализация участка связывания бета-лактамных нуклеофилов.Определениепродуктивногосайтасвязываниянуклеофилавацилфермент-нуклеофильном комплексе является нетривиальной задачей из-за низкой прочности такихкомплексов (оценка константы связывания нуклеофила составляет1-10 мМ,чтосоответствует энергии связывания -4ккал/моль).
В то же время в работе [64] с помощьюопределенных подходов удалось получить комплексы, стабильные в течение 10 нс. Вполученных ацилфермент-нуклеофильных комплексах аминогруппа нуклеофила (6-АПК)занимает строго определенное положение, образуя водородные связи с терминальным азотомb-цепи фермента и кислородом основной цепи остатка bQ23. Эти водородные связификсируют аминогруппу нуклеофила в положении, благоприятном для нуклеофильной атаки:электронная пара аминогруппы нуклеофила обращается к атакуемому карбонильному атомууглерода ацилфермента, и становится возможным перенос протона с аминогруппынуклеофила на концевую аминогруппу b-цепи ацилфермента (рис.13).Рисунок 13.
Продуктивное связывание 6-АПК в D-ФГ-ecПА.34С другой стороны, такое расположение аминогруппы нуклеофила оказываетсяблагоприятным и для связывания бета-лактамного ядра. Поскольку взаимная ориентацияаминогруппы и остальной части субстрата жестко связаны, фиксация аминогруппы вактивном центре фермента ведет к тому, что карбонильный кислород 4-х членного кольца икарбоксильная группа субстрата связываются в строго определенном месте, а именно,образуют водородные связи с остатками bR263, bS386.Сравнение сайтов связывания бета-лактамного ядра в продуктивных комплексах ПенG и 6-АПК показывает ряд существенных различий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
