Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Кинтетические параметры гидролиза NIPAB для ecПА ДТ и мутантов поостатку bF71.Фермент kcat (c-1) KM (мкМ) kcat/KM (c-1мкM-1)ДТ20181,1bF71C193,16,1bF71L373,411При изучении денатурации в 4,5 М растворе мочевины наблюдали существенноеулучшение стабильности для мутанта bF71C. При pH 8,0 и температуре 54°С фиксировали 2кратное увеличение времени полуинактивации (t1/2) для обоих мутантов.
Данные мутантыоказались также более стабильными при повышенных pH. При изучении остаточнойактивности при pH 10,8 в присутствии NIPAB были получены следующие данные дляконстант инактивации первого порядка (ki): ecПА ДТ 2,3·10-3, bF71C 3,8·10-5, bF71L 1,3·10-4 c1.Однако,методика изучения pH-стабильности не соответствует общепринятой, так какналичие субстрата, может сильно повлиять на интерпретацию результатов. Не понятно, что вданном случае является решающим: то ли сохранениестабильности, то ли простоповышенная каталитическая активность мутантов.Шаповаловой И.В. [100; 101] было проведено исследование энантиоселективностиферментных препаратов ecПА, содержащих мутации по остатку bF71 в реакциях гидролизаN-фенилацетильных производных фенилглицина и аспарагиновой кислоты (табл.
13).Таблица 13. Стереоселективность (E) в реакции гидролиза N-фенилацетильныхпроизводных ФГ и аспарагиновой кислоты для ecПА ДТ и мутантов по остатку bF71.Фермент E (ФГ) E (Асп.)ДТ1960120bF71K1200018bF71E580063bF71L22017055bF71Y238010bF71R30030bF71W170046bF71H210012Было показано, что введение мутаций bF71K и bF71E способствует увеличениюстереоселективности фермента в 3-6 раз в случае ФГ в амидной части субстрата. В случаеаспарагиновой кислоты, когда хиральная дискриминация субстратов представляет болеесложную задачу, некоторое увеличение стереоселективности наблюдали только для мутацииbF71L.Ямсковой О.В.
было проведено детальное исследование кинетических параметровмутантных форм ecПА, содержащих мутации по остаткам aR145, aS149, bF71, bT384 иbG385 в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и установлено, чтомутации aR145L и bF71L приводят к значительному улучшению стереоселективности вреакциях ацилирования аминоспиртов (табл. 14) и гидролиза их N-фенилацетильныхпроизводных (табл. 15) [55].
Также наблюдалось существенное улучшение эффективности искорости синтеза по сравнению с ecПА ДТ. Однако, несмотря на довольно существенныеулучшения стереоселективности, величина параметра все еще на порядок ниже, чем дляаминокислот, и недостаточна для получения препарата в энантиомерно чистой форме.Таблица 14.Кинетическиепараметрыферментативногостереоселективногоацилирования рацемата 2-АБ амидом R-МК (pH 9,5, 25oC).Фермент ОИ кат ОИ S/H ЕДТ1126bF71L228,595aR145L6,33,83556Таблица 15.
Стереоселективность в реакции гидролиза N-(R)-манделил-производныхаминосоединений для ecПА ДТ и мутантных форм bF71L и aR145L (pH 7,5, 25oC).СубстратE (ДТ) E (bF71L) E (aR145L)N-(R)-Манделил-(±)-2-АБ2510037N-(R)-Манделил-(±)-ФА4,2397,4Авторы работы [9] изучали аминокислотные остатки, расположенные на поверхностибелковой глобулы, и продемонстрировали, что изменение поверхностного заряда можетповлиять на стабильность фермента при определенных pH. С помощью вычисленийэлектростатических потенциалов в программе DELPHI авторы предложили мутациюbW431R, локализованную на расстоянии 32Å от активного центра, которая привела к 2кратному увеличению t1/2 при pH 8,5.
Данный эффект обусловлен, предположительно,взаимодействием аргинина и bQ318 на соседней альфа спирали. Хотя сам по себе низкий повеличине эффект вряд ли имеет практическую ценность, однако, может найти свое место вмноготочечных конструкциях.В работе [102] китайскими учеными были получены мутанты bmПА, которыеоказались более термостабильными, а также устойчивыми в присутствии органическихрастворителей. При этом авторы опирались на то положение, что фермент более стабиленпри pH близком к pI. Для понижения pI были произведены замены поверхностныхположительно заряженных неконсервативных остатков K на нейтральные маленькие А –bK427A, bK430A, bK427A+bK430A, что привело к гидрофобизации поверхности белка и,какследствие,стабилизациипоотношениюкорганическимрастворителям(диметилформамид).
Для двойного мутанта также было зафиксировано 2-кратное увеличениеt1/2 при 55°С, что делает его сравнимым с afПА. К сожалению, в методической части авторыне приводят никаких пояснений к кинетическим экспериментам. Также по частитермостабильности отсутствует иллюстративный материал, что вызывает некотороенедоверие к полученным результатам.Юрьеву Р. с соавторами удалось получить мутант afПА, в котором а-цепь остаетсясвязанной с природным линкером за счет двух мутаций T206G+S213G, которые приводили к57заметному замедлению процессинга [103].
Для данного мутанта характерно 2-кратноеувеличение kcat и 3-кратное уменьшение KM в реакции гидролиза пG по сравнению с afПАДТ. Также данный мутант обладает повышенной операционной стабильностью присохранении термо- и pH-стабильности.Вработеспецифичность[10]ecПАкорейскиенаученыеизменилицефалоспориновую,природнуюоткрываятемпенициллиновуюсамымвозможностьиспользования ПА в реакции цС. Для этого было проведено структурное выравнивание дляecПА и pdЦА (23% идентичности ecПА), с целью установления соответствия остатков,ответственных за связывание ароматической гидрофобной ацильной части пенициллина вecПА и линейной гидрофильной ацильной части цефалоспорина в pdЦА (табл.16).Таблица 16. Соответствие остатков ecПА и pdЦА.ecПАpdЦАОстатки важныеbSer1bSer1для катализаbGln23bHis23bAla69bVal70bAsn241 bAsn244Остатки, формирующие bVal56bArg57участок связыванияaPhe146aTyr149ацильной частиbThr32bTyr33bIle177bPhe177bPro49bGln50bTrp154bTyr153bPhe24bLeu24Далее, 7 остатков гидрофобного кармана ecПА заменили на соответствующие 7остатков из pdЦА.
Полученный таким образом многоточечный мутант характеризовался 8кратным улучшением специфичности по отношению к цефалоспорину. Но, к сожалению, этирезультаты представляют собой не более чем научную ценность, так как специфичнаяактивность природного цефалоспоринового фермента осталась недостижима.1.2.2.3 Комбинированные методы58SSMМетодика сайт-насыщающего мутагенеза была реализована в работе [5].
Совместнымиусилиями российских и голландских ученых удалось добиться значительного увеличенияпараметра β за счет мутаций по остатку aR145, который по данным РСА и, в соответствии спредставлениями работы [104], может опосредованно взаимодействовать с карбоксильнойгруппойПен-G.Предварительныеисследованияреакцииферментативногосинтезаампициллина в разбавленных растворах показали, что у всех 19-и мутантов возрастаетспособность к переносу ацильной группы на 6-АПК. Затем были отобраны 3 наиболееперспективных мутанта - aR145L, aR145G, aR145S и проведено детальное изучениекинетических параметров (рис.25, табл.17).Рисунок 25. Нуклеофильная реакционная способность 6-АПК в реакции 1а для ecПА имутантов по остатку aR145.59Таблица 17.
Эффективные кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и еемутантов по остатку aR145.αβ, М-1γPmax, мМДТ7.7800.142.2aR145G294200.043.6aR145S143500.053.3aR145L152800.062.8ФерментПолученные данные свидетельствуют о том, что удаление положительного заряда впозиции а145 приводит к значительному увеличению нуклеофильной способности 6-АПК.Почти синхронное увеличение параметра может свидетельствовать о том, что улучшениесвязывания нуклеофила (Kn↓), выраженное в увеличении параметра , неизбежно ведет кулучшению связывания продукта синтеза (Kp↓), и невозможно улучшить оба параметраодновременно, в той степени, в которой невозможно различить связывание нуклеофила ипродукта (рассмотрение данного вопроса см.3.7).
Однако негативное влияние можно вкакой-то степени снизить, если выводить ампициллин из сферы реакции или использоватьразличие в амидазной/эстеразной активности фермента в случае, если донором ацильнойчасти является эфир.Стереоселективность ПА в отношении фенилацетильных производных с Cα-X группойне высока, поэтому в реакциях синтеза полусинтетических бета-лактамных антибиотиковиспользуются энантиомерно чистые ацильные доноры. В работе [6] авторы применили методSSM для улучшения стереоселективности ecПА в отношении D-ФГ, что делает возможнымиспользовать более дешевый рацемат донора.
Исходно, при использовании рацематаметилового эфира ФГ удается получить R-ампициллин с энантиомерным избытком (э.и.) 37%при достижении максимального выхода. Для дизайна стереоселективности были отобраны 5остатков на расстоянии <6Å от Сα-атома сульфоксида Пен-G в структуре 1gm9: aF146, bP22,bF24, bT68 и bF71, каждый из которых подвергли насыщающему NNK мутагенезу. Врезультате из пяти библиотек были отобраны 23% активных варианта, среди которых 14%характеризовались улучшением стереоселективности в реакции синтеза (R)-ампициллина и6059% - в реакции синтеза (S)-ампициллина, что, по результатам секвенирования, соответствует4 и 8 неповторяющимся вариантам (табл.18, представлены лучшие варианты).Таблица 18.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
