Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Это дало основание авторампредположить участие данных остатков в связывании амидной части субстрата. Однако,49после появления PCA структуры ecПА стало понятно, что эти остатки находятся слишкомдалеко от активного центра и вряд ли могут принимать участие в узнавании субстрата.Анализ РСАПосле того как был проведен первый рентгеноструктурный анализ ecПА [16], сталовозможным определение роли тех или иных остатков в активном центре, что сформировалопредпосылки для рационального подхода к дизайну фермента.
В наиболее значимых работах[5; 65; 98; 99] основные усилия были направлены на изменение участков связыванияацильного донора и β-лактамного нуклеофила. Различные мутации по остаткам aR145,aF146, bF24 привели к заметному улучшению параметров S/H, α, β, γ и, как следствие,выхода в реакциях 1-6.
Однако, во многих случаях наблюдали существенную потерюактивности и стабильности. Конкретные примеры мутаций рассмотрены ниже.С целью получить структурную информацию об участке связывания амидной частисубстрата, авторы работы [65] провели РСА неактивного мутанта bN241A в комплексе сПен-G (1fxv). Было установлено, что бета-лактам связывающий сайт формируется боковымичастями остатков aF146 и bF71, которые имеют Ван-дер-Ваальсовы контакты стиазалидиновым кольцом Пен-G, а также остатком aR145, взаимодействующим скарбоксильной группой субстрата посредством двух мостиковых молекул воды (чего,однако, не наблюдается, например, в структуре 1gm9).
Роль остатка aF146 затем изучилипри помощи направленного мутагенеза. Было показано, что удаление ароматическогоостатка в мутантах aF146L и aF146A приводит к значительному ухудшению реакционнойспособности фенилацетилированных субстратов (табл.9), однако, в тоже время наблюдаетсязаметное улучшение S/H в реакции синтеза Пен-G при заметном ухудшении связывания 6АПК.Таблица 9. Кинетические характеристики ecПА ДТ и мутантов по остатку aF146.ФерментФААNIPAB6-АПКkcat/KMkcat/KMKi-1 -1-1 -1(мкМ с ) (мкМ с )(мМ)0,311,4332aF146Y0,50,3828aF146A5,8·10-33,0·10-3180aF146L1,7·10-31,5·10-311650Замена же на родственный Y приводит к ухудшению синтетических способностейфермента при неизменности константы связывания (ингибирования) 6-АПК.
Данный примериллюстрирует, что не только связывание 6-АПК может играть ключевую роль в различиисинтетических способностей фермента. При изучении роли соседнего остатка aR145 теми жеавторами в работе [66] было обнаружено, что замены его на С, K и L приводят к 3-6-кратномуувеличению параметра S/H в реакции синтеза ампициллина. Однако, активность в реакциипG падает более чем на порядок.В работе [98] авторы решили изучить роль гидрофобных остатков в реакцияхгидролиза и синтеза бета-лактамных антибиотиков.
C этой целью был проведен мутационныйанализ 3-х фенилаланинов - aF146, bF24 и bF57- в активом центре ecПА (рис 23). По даннымРСА (1pnl) остаток bF24 находится в стэкинге с фенильнымкольцом субстрата, остаток aF146 локализован на входе вгидрофобный карман, а остаток bF57 находится на дне кармана иможет быть важен в поддержании структуры связывающегосайта. Данные остатки заменяли на Y,W,A и L, что моглоповлиять на форму и размер ацил-связывающего кармана присохранении его гидрофобности. Во всех случаях наблюдалиРисунок 23.Гидрофобный карманecПА в структуре 1pnl.уменьшение константы специфичности в реакции гидролизаNIPAB, что говорит о важной роли данных остатков вправильном связывании субстрата. В реакции 1а, аналогичнореакции гидролиза NIPAB, во всех случаях наблюдали падениеактивности, за исключением мутанта bF146Y. Следует отметить, что это единственныймутант, для которого было характерно улучшение KM (3 раза) в реакции гидролиза NIPAB, атакже уменьшение константы ингибирования ФУК.
Однако в реакции 1а данный мутантоказался наихудшим в отношении S/H (40 раз). Мутации по остатку bF57 не привели ксущественным изменениям в S/H в реакции 1a, а наибольший эффект наблюдали для мутацийbF24A (2 раза) и aF146L(3 раза). Однако, скорость ацилирования для обоих мутантов была в10 и 20 раз ниже, соответственно. Поскольку скорость ацильного переноса с эфиров обычновыше, чем с амидов, оба мутанта протестировали в реакции 1э, при этом для мутанта bF24Aнаблюдали сравнимую с ДТ активность и почти 3-кратное увеличение выхода ампициллина.Мутант же aF146L оказался в 20 раз менее активным. Таким образом, мутант bF24A потеряламидазную активность, но сохранил эстеразную, а мутант aF146L потерял и ту и другую51активности. В связи с этим, оставшуюся часть работы авторы посвятили изучению свойствмутации bF24A.
При изучении стационарной кинетики с широким спектром ацильныхдонороввыяснилось,чтомутацияпомимоbF24A,увеличенияотношенияэстеразной/амидазной активности, приводит к улучшению связывания Cα-замещенныхсинтетических ацильных доноров по сравнению с ФУК, а также к уменьшениюингибирования самой ФУК. Для изучения синтетических способностей мутанта былиопределены параметры альфа и S/H для реакций 1a-4a и 1э-4э (табл.10).Таблица 10. Кинетические параметры синтеза полусинтетических бета-лактамныхантибиотиков для ecПА ДТ и bF24A.αS/HРеакцияДТbF24AДТbF24A1а1,42,916,037,51э1,43,12,90,92а1,73,122,214,62э1,83,015,40,43а4,915,863,343,53э5,218,411,41,14а4,615,055,670,84э5,221,038,52,0Исходя из представленных данных, можно сделать вывод, что в реакциях 1э-4э длямутанта bF24A характерно одновременное улучшение обоих параметров.
При изучениизависимости S/H от концентрации нуклеофила в реакции 1а также было показано улучшениепараметра γ, что делает данный мутант выгодным в более широком диапазоне начальныхконцентраций. Также авторами была изучена интегральная кинетика реакций 1а, 1э, 3а и 3э,которая подтвердила существенное превосходство мутанта bF24A в отношении выхода дляреакций с эфирами (рис.24).
Однако, к сожалению, эфиры в технологическом отношении нестоль удобны, как амиды, что в первую очередь связано с их повышенной лабильностью.52Риcунок 24. Кинетически контролируемый синтез ампициллина и цефалексина прииспользовании ecПА ДТ (пунктир) и bF24A (сплошная). A–реакция 3э, B–реакция 3а, С–реакция 1э, D–реакция 1а. (● - антибиотик, ■ - ФГ).Дляэффективногосинтезаполусинтетическихбета-лактамныхантибиотиков(ампициллин, амоксициллин, цефадроксил и др.) благоприятна низкая специфичность к ФУКи высокая к Cα-замещенным производным ФУК. В работе [99] голландские ученые получили3 мутанта – aF146Y, bF24A и aF146Y+bF24A, удовлетворяющие данным требованиям.Удаление ароматического кольца в мутанте bF24A приводит к структурным перестройкам вактивном центре, в результате чего ФУК связывается в существенно менее активнойоткрытой конформации, в то время как в ДТ ФУК связывается в закрытой конформации.
Приэтом исчезают водородные связи между карбонильным кислородом ФУК и остатками βA69 иN241, образующими оксианионный центр, что объясняет 20-кратное ухудшение связывания(табл.11). В отличие от ФУК, Cα-X-ФУК (X=CH3, OH, NH2) связывается в закрытойконформации, при этом Cα-X занимает место удаленной фенильной группы, что приводит ксущественному улучшению связывания.53Таблица 11. Константы ингибирования ecПА и ее мутантов Сα-замещеннымипроизводными ФУК.СубстратecПАbF24AaF146YKi (мМ) KiR/KiS Ki (мМ) KiR/KiS Ki (мМ)bF24A+ aF146YKiR/KiS Ki (мМ) KiR/KiSФУК0,06(R)-α-CH3-ФУК0,47(S)-α-CH3-ФУК1,1(R)-МК31(S)-МК105,74,18,2(R)-ФГА40254151,10,420,120,030,0831,53,13,50,210,250,50,61130,0760,210,362,96,20,76Интересно также заметить, что мутация по остатку βF24 оказывает сильное влияние настереоспецифичность фермента по отношению к (R)-изомерам Cα-замещенных ФУК и можетрассматриваться как потенциальная мишень для изменения энантиоизбирательностифермента с целью получения оптически чистых Сα-замещенных производных ФУК (идеяреализована в работе [6], см.
далее). Замена αF146Y не сопровождается конформационнымиперестройками в активном центре. При этом наблюдается аналогичное есПА ДТ связываниеФУК. Однако, при связывании Cα-замещенных ФУК образующиеся Ван-дер-Ваальсовыконтакты между Cα-заместителем и αY146:OH делают связывание более продуктивным.
Какуже было отмечено выше, данные мутации имеют ряд недостатков. Так для мутации bF24Aхарактерно значительное падение амидазной активности [98], а для мутации bF146Yнаблюдается существенное ухудшение эффективности синтеза [65].В работах [8; 100] авторы получили и детально изучили мутанты bF71L и bF71C,обнаруженные ранее методом «направленной эволюции» в работе [90]. Данные мутацииприводят к более чем 100-кратному улучшению константы специфичности в реакциигидролиза глутарил-лейцина при pH 6,0 по сравнению с ecПА ДТ. При изучении кинетикиреакции гидролиза NIPAB также были отмечены значительные улучшения константыспецифичности, в основном за счет улучшения связывания (табл.12).54Таблица 12.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
