Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Если в продуктивном комплексе Пен-Gкарбоксильная группа бета-лактамного ядра связывается с остатком bN388 и находится внепосредственной близости от аргинина bR263, то 6-АПК в комплексе с ацилферментомболее подвижна, и ее карбоксильная группа в большей степени экспонирована в раствор,располагаясь практически на равном расстоянии от обоих положительно заряженныхостатков активного центра – aR145 и bR263, при этом с остатком bR263 молекулануклеофила образует водородную связь своим карбонильным кислородом, а остаток aR145контактирует исключительно с гидрофобной частью 6-АПК (рис.13).351.2.Белковая инженерия и поиск новых ПАНесмотря на огромное число уже описанных ферментов, текущий запрос на новыебиокатализаторы с измененными свойствами продолжает расти.
Такие свойства ферментов,каксубстратнаяспецифичность,хемио-,регио-илиэнантиоселективность,термостабильность, pH профиль, операционная стабильность и др., формируют постоянныйинтерес со стороны биотехнологии. Для удовлетворения этого интереса и полученияподходящего биокатализатора для того или иного процесса, можно выделить триосновополагающие стратегии:Во-первых,этобиокатализаторовсбиоинформатикипоискпривлечениемили[68]экспериментальногоприродныхскринингаметодовприпомощиразличныхколлекцийштаммов [69], а также метагеномных библиотек [70–72]. Вотношении ПА реализация данной стратегии представленав разделе 1.2.1.Во-вторых,созданиебиокатализатораdenovo,которое включает определение переходного состояния длярассматриваемой реакции, предложение активного сайта,способного стабилизировать данное состояние (QM/MMмоделирование) и, наконец, встраивание активного сайта всуществующийбелковыйкаркас(например,обратныйROSETTA алгоритм [73]).
Теоретически сюда же можноотнестиполучениебиокаталитическихмоноклональныхантител - абзимов, где на первом этапе аналогом переходногосостояния выступает фосфорорганическое соединениe [74; 75]В-третьих, это улучшения каталитических свойств существующих ферментовметодами белковой инженерии. Белковая инженерия представляет мощный инструмент дляулучшения каталитических свойств фермента в реакциях, в той мере в какой они не36являются природной функцией фермента.
Для этого используют подходы, которые условноможно разделить на методы случайного и направленного мутагенеза (рис.14).«направленная эволюция» [90]SSM [146]анализ выравниваний [95]ДНК-шаффлинг [152]CASTing/ISM [147] [148],анализ РСА [142]циклическая пермутауция [94]ProSAR [149] ,докинг субстратов [143],epPCR [153]консенсусный подход [150],гомологичное модел. [144]3DM [151]in silico дизайн [145]Рис.14 Методы белковой инженерии. Приведены ссылки на наиболее характерныеработы.При отсутствии или недостатке информации о структуре белка чаще прибегают кподходам случайного мутагенеза.
Существенным ограничением случайного мутагенезаявляется необходимость наличия высокопроизводительного скрининга при изучениибольших библиотек мутантов. При наличии структурной информации, но отсутствиичеткогопониманияструктурно-функциональныхсвязейвозможноиспользоватькомбинированные методы случайного и направленного мутагенеза, что может существенноулучшить качество и уменьшить объем изучаемой библиотеки. Непосредственно кнаправленному мутагенезу прибегают при высоком уровне понимания структурнофункциональных особенностей, а также при использовании методов молекулярногомоделирования.
В отношении ПА стратегия белковой инженерии представлена в разделе1.2.2.371.2.1 Поиск природных ПАВ настоящее время известны ПА из более чем 40 бактерий. Филогенетическое дереводля некоторых из них представлено на рисунке 15.Рисунок 15. Филогенетическое дерево ПА, найденных при помощи BLAST.
Сероеполе содержит ПА, последовательности которых идентичны не менее чем на 40%.Посредством функционального скрининга библиотеки генов почвенной культурыавторами работы [72] была обнаружена пенициллинацилаза PAS2 на 51% идентичная ecПА.По сравнению с ecПА для PAS2 характерно 5-кратное улучшение связывания ФУК (табл.1),что является негативным фактором при использовании фермента в промышленно значимойреакции пG.
В реакции гидролиза NIPAB PAS2 характеризуется 4-кратным уменьшениемконстанты Михаэлиса и 5-кратным улучшением константы специфичности по сравнению сecПА. В реакции гидролиза ампициллина PAS2 показывает 5-кратное улучшение константыМихаэлиса.38Таблица1.Кинетическиепараметрыгидролизаразличныхсубстратов,катализируемых PAS2 и ecПА [72].ecПАPAS2Субстратkcat, c-1KM, мМkcat/KM,kcat, c-1KM, мМkcat/KM,NIPAB240,0046000180,0151200NIPGB120,64618,6141,310,8ФАА230,03767460,156295п-ОН-ФАА290,0271074470,114412ФГ амид25122,157301,9п-ОН-ФГ амид169,11,82512,22,3Пен-G250,0122083390,0133000Ампициллин160,57527,8252,510Амоксициллин150,39937,6171,0715,9Цефалексин201,315,4291,519,3Цефадроксил130,28445,8320,64249,8В отношении реакций синтеза пенициллинов PAS2 характеризуется значительнымувеличением параметра β (табл.2).
Однако параллельно происходит увеличение параметра α,что негативно сказывается на выходе целевого антибиотика. Исключение составляет реакциясинтеза Пен-G (0a), для которой наблюдается одновременное улучшение всех кинетическихпараметров, что приводит к более чем 2-кратному увеличению выхода целевого продукта.Таблица 2. Комплексные кинетические параметры в реакции синтеза различныхантибиотиков, катализируемых PAS2 и ecПА (pH 7, 30°C).Реакцияβ, M-1α1/γPmax, мMPAS2ecПАPAS2ecПАPAS2ecПАPAS2ecПА0а2,710,23733031н.д.1,80,81a13,25,344876652,422а20,96,9560861952,71,73а7,310,250963859364,13,74а25,421,7444427н.д.н.д.2,42,239Также следует отметить 3-кратное увеличение параметра 1/γ (максимальнодостижимый S/H) в реакции синтеза амоксициллина, что хорошо иллюстрирует графикзависимости S/H от концентрации нуклеофила на рисунке 16.Рисунок 16.
Синтез ампициллина при помощи PAS2(●) и ecPA(■) и амоксициллинапри помощи PAS2(○) и ecPA(□).Возможности белковой инженерии представляют большой интерес для дальнейшейоптимизации PAS2, что и было сделано теми же авторами в работе [76] (см. описание вразделе 1.2.2)В работе [77] описана asПА (52% идентичности ecПА), для которой каталитическаяактивность в реакции пG в 1,5 раза выше, чем для ecПА. Данный фермент способен такжекатализировать гидролиз пенициллинов, содержащих α-аминогруппу в ацильной части, в 2раза лучше, чем Пен-G (табл.3) и, похоже, это единственная из описанных ПА, котораяспособна гидролизовать ампициллин быстрее, чем Пен-G.
В данном отношении особыйинтерес представляет гидролаза эфиров α-аминоксилот (АЭГ, [78]), однако, ее рассмотрениевыходит за рамки данного обзора.Таблица 3. Субстратная специфичность ПА и АЭГ из различных организмов.Относительная активность,%Ферм.Пен-GПен-VАмпициллин Амоксициллин Цефалексин NIPABasПА1002319719919065ecПА1001051386132afПА1001283н.д.н.д.н.д.40bmПА100035н.д.н.д.н.д.prПА1001325н.д.н.д.н.д.AЭГн.д.н.д.1006214н.д.slПА (12% идентичности ecПА) с повышенной специфичностью к ФОУК (Пен-V) иеще более к длинным алифатическим остаткам (Пен-K) описана в работе [79] (табл.4).
Приэтом slПА практически неспецифична к ФУК (Пен-G), в связи с чем данный ферментпринято относить к классу пенициллин-V-ацилаз.Таблица 4. Каталитические характеристики slПА.Субстрат ацильная часть kcat, c-1 KM, мМ kcat/KM,мМ-1 с-1Пен-VФОУК60,252,0539Пен-F3-гексеноил7,691,26,4Пен-Kоктаноил22,710,14165Пен-GФУК3,460,20,08kcПА (85% идентичности ecПА) [80] характеризуется сдвинутым, по сравнению сecПА, в область более высоких значений температур профилем активности и раcширеннымв обе стороны профилем pH-стабильности (рис.17)Рисунок 17. Температурный (слева) и pH (справа) профили активности kcПА.bmПА (29% идентичности ecПА) описана в работе [81] и также характеризуетсясдвинутым в щелочную область pH профилем активности (рис.18).41Рисунок 18. pH профиль активности для bmПА.Для krПА известно, что параметр β в реакции 2а на 20% больше, чем в случае ecПА,однако параметр α увеличен на 63%, что, в конечном итоге, негативно сказывается навыходе целевого продукта [82]. Также в работе [83] было показано, что среди четырех ПА(krПА, ecПА, prПА и afПА), krПА обладает наилучшим показателем S/H в реакции 3а(рис.19).Рисунок 19.
S/H в реакции 3a для ПА из 4-х различных источников.Термостабильная afПА (39% идентичности ecПА) представлена голландскимиучеными в работе [84]. Активность afПА не изменяется при инкубировании при 50°С втечение 20 мин, в то время как ecПА при тех же условиях необратимо теряет половинуисходной активности. Улучшение термостабильности afПА авторы приписывают наличию вструктуре дисульфидного мостика от двух цистеинов, которых нет у ecПА (см.3.2.4.6). Вотношении реакции гидролиза NIPAB afПА обладает в 6 раз более высокой константойспецифичности (kcat/KM), а в отношении реакции пG в 3 раза более высокой, чем ecПА(табл.5)42Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и Пен-G.Фермент NIPAB-1kcat, cПен-GKM, мкМ kcat, c-1 KM, мкМecПА25(15)15(30)48(50)4,6(3,8)afПА50(95)5,1(4,5)63(54)2(4,2)Эти данные несколько расходятся с данными работы [85] (табл.5 в скобках), которыесвидетельствуют в сторону еще большего (42 раза) увеличения константы специфичности вреакции гидролиза NIPAB.
Таким образом, авторы заявляют, что afПА является самойактивной в реакциях гидролиза NIPAB и Пен-G среди описанных на текущий момент (1996г.) пенициллинацилаз. Также следует особо отметить сильно сдвинутый в щелочную областьpH профиль активности (рис.20), что выгодно отличает afПА от многих других известныхПА, расширяет область ее применения и возможности для выделения и очистки.Рисунок 20. Профиль каталитической активности afПА.В работе [86] китайскими учеными представлена axПА (51% идентичности ecПА).
Помнению авторов, это самая термостабильная ПА из всех ранее описанных в литературе намомент публикации. t1/2 при 55°С (рис.21) в 4 раза больше, чем для afПА, а оптимумактивности приходится на температуру выше 60°С (рис.22 слева). pH оптимум смещен всторону более высоких значений и составляет pH 8,5 (рис. 22 справа).43Рисунок 21. Термоинактивация axПА и ecПА. ♦ - axПА при 55°С,▲ - axПА при 60°С,■ - ecПА при 55°С, х - ecПА при 60°С.Рисунок 22. Температурный (слева) и pH (справа) профили активности axПА.По результатам гомологичного структурного моделирования и выравниванияпервичных последовательностей было показано, что axПА обладает повышенным числомвнутренних ион-парных сеток, пониженным содержанием N и Q, большим количеством R, атакже значительным числом P, что вносит существенный вклад в стабильность фермента(табл.6).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
