Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631)
Текст из файла
Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова________________________________________________________________________________Факультет биоинженерии и биоинформатикиНаучно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерскогона правах рукописиПанин Николай ВладимировичНаправленный мутагенез пенициллинацилазы из E.coliдля изменения каталитических свойств и стабильности02.00.15 кинетика и катализ03.01.06 биотехнология(в том числе бионанотехнологии)диссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучные руководители:д.х.н., профессор Швядас В.К.к.х.н., в.н.с.
Гуранда Д.Т.Москва 2014Диссертация посвящается светлой памяти моего отцаПанина Владимира Григорьевича.2ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................. 7ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................................... 121 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ........................................................................................................ 151.1 Пенициллинацилаза ..................................................................................................................
151.1.1 Общие сведения................................................................................................................ 151.1.1.1 Физиологическая роль ПА ............................................................................................. 151.1.1.2 Каталитическая активность ..................................................................................... 151.1.1.3 Субстратная специфичность ..................................................................................... 161.1.1.4 Стереоспецифичность .................................................................................................
181.1.2 Основные области применения ПА ................................................................................ 191.1.2.1 Получение бета-лактамных антибиотиков .............................................................. 191.1.2.2 Разделение энантиомеров аминосоединений ............................................................. 241.1.3 Структурно-функциональные особенности ecПА ........................................................ 261.1.3.1 Структура предшественника ..................................................................................... 261.1.3.2 Активный центр............................................................................................................ 261.1.3.3 Механизм катализа .......................................................................................................
271.1.3.4 Конформационные переходы в активном центре. .................................................... 291.1.3.5 Участок связывания ацильной части. ........................................................................ 311.1.3.6 Участок связывания амидной части. ......................................................................... 321.1.3.7 Локализация участка связывания бета-лактамных нуклеофилов.
.......................... 341.2.Белковая инженерия и поиск новых ПА............................................................................... 361.2.1 Поиск природных ПА ...................................................................................................... 381.2.2 Белковая инженерия ПА ..................................................................................................
4631.2.2.1 Случайный мутагенез ................................................................................................... 461.2.2.2 Направленный мутагенез ............................................................................................. 491.2.2.3 Комбинированные методы .......................................................................................... 581.2.2.4 Расширение возможностей белковой инженерии .....................................................
661.2.3 Заключение ....................................................................................................................... 682 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................................................... 702.1 Материалы и оборудование ..................................................................................................... 702.2 Методы ......................................................................................................................................... 732.2.1 QuikChange ПЦР мутагенез .............................................................................................
732.2.2 ПЦР мутагенез с перекрыванием.................................................................................... 742.2.3 Наработка биомассы ........................................................................................................ 752.2.4 Выделение и очистка мутантных препаратов ПА......................................................... 752.2.5 Приготовление компетентных клеток ............................................................................
762.2.6 Электрофорез в агарозном геле ...................................................................................... 772.2.7 Электрофорез в полиакриламидном геле ...................................................................... 772.2.8 Секвенирование ................................................................................................................
792.2.9 Титрование активных центров ........................................................................................ 792.2.10 Определение кинетических параметров гидролиза цветного субстрата .................. 792.2.11 Изучение pH- и термостабильности ............................................................................. 792.2.12 Ингибиторный анализ .................................................................................................... 802.2.13 Определение параметра S/H .......................................................................................... 802.2.14 Определение параметров β и γ ...................................................................................... 812.2.15 Определение параметра α .............................................................................................. 812.2.16 Определение максимального выхода реакции ............................................................
812.2.17 Определение стереоселективности в реакции ацилирования 2-аминобутанола ифенилаланинола ........................................................................................................................ 8242.2.18Определениестереоселективностивреакциигидролизафенилацетилфенилаланинола .................................................................................................. 822.2.19 ВЭЖХ .............................................................................................................................. 832.2.20 Компьютерное моделирование .....................................................................................
852.2.21 Методы статистической обработки результатов......................................................... 863 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .......................................................................................... 873.1 Постановка задачи ..................................................................................................................... 873.2 Получение генов мутантных форм......................................................................................... 913.3 Экспрессия, выделение и очистка .......................................................................................... 963.4 Титрование активных центров, каталитическая активность и термостабильность ..
983.5 Эффективность синтеза .......................................................................................................... 1033.5.1 Определение параметров α,β,γ ..................................................................................... 1033.5.2 Уточнение к вычислению параметра α. ...................................................................... 1073.6 Стереоселективность .............................................................................................................. 1103.7 Анализ экспериментальных данных ................................................................................... 1163.8 Мутагенез для изменения каталитической активности ..................................................
1213.8.1 Мутации bS1T, bS1C, bT68S, bS1T+bT68S................................................................... 1213.8.2 Мутации bI177V, bW154F ............................................................................................. 1253.9 Мутагенез для изменения эффективности синтеза ...........................................................
1273.9.1 Мутации bF24A, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256R .......................................... 1273.9.2 Мутация aS149R............................................................................................................. 1343.9.3 Мутация bN388Q ........................................................................................................... 1373.9.4 Мутации bF256R, bA255R .............................................................................................
1413.10 Мутагенез для изменения стереоселективности.............................................................. 1473.10.1 Мутации bF71L, bF71A ............................................................................................... 1473.11 Мутагенез для изменения стабильности ........................................................................... 15453.11.1 Мутации bQ292R, bI329E ............................................................................................ 1543.11.2 Мутации bD484N, bD484H..........................................................................................
1573.11.3 Мутация bR297A .......................................................................................................... 1633.11.5 Мутация aA173C+bA410C .......................................................................................... 1663.11.6 Мутации bR533C+bW500C, bM485R ......................................................................... 167ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ............................................................................
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
