Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 2
Текст из файла (страница 2)
169СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................... 170ПРИЛОЖЕНИЯ ............................................................................................................................ 182Приложение 1: «Парное выравнивание первичных аминокислотных последовательностейПА» ........................................................................................................................................... 182Приложение 2. «Праймеры».
................................................................................................. 188Приложение 3. «Программа» ................................................................................................. 191Приложение 4. «Биоинформатический анализ семейства ПА».......................................... 2006СПИСОК СОКРАЩЕНИЙПАпенициллинацилаза;ДТдикий тип;abПАпенициллинацилаза из Acinetobacter baumannii;afПАпенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis;apПАпенициллинацилаза из Acetobacter pasteurianum;asПАпенициллинацилаза из Achromobacter species;avПАпенициллинацилаза из Arthrobacter viscosis;axПАпенициллинацилаза из Achromobacter xylosoxidans;bmПАпенициллинацилаза из Bacillus megaterium;eсПАпенициллинацилаза из Escherichia coli;kcПАпенициллинацилаза из Kluyvera citrophila;krПАпенициллинацилаза из Kluyvera cryocrescens;prПАпенициллинацилаза из Providencia rettgeri;slПАпенициллинацилаза из Streptomyces lavendulae;smПАпенициллинацилаза из Stenotrophomonas maltophila;ttПАпенициллинацилаза из Thermus thermophilus;xcПАпенициллинацилаза из Xanthomonas citrii;pdЦАцефалоспоринацилаза из Pseudomonas diminuta;AГЛАацил-гомосеринлактон ацилазы;ГАглутарил-7-АЦК ацилазы;Пен-Gпенициллин-G;7NIPABм-карбокси-п-нитроанилид ФУК;NIPGBм-карбокси-п-нитроанилид D-ФГ;ФМСФфенилметилсульфонил фторид;ФУКфенилуксусная кислота;ФААфенилацетамид;ФОУКфеноксиуксусная кислота;D-ФГD-фенилглицин;п-OH-D-ФГ пара-гидрокси-D-фенилглицин;D-2,5-дФГD-2,5-дигидрофенилглицин;ТЗУтетразолилуксусная кислота;МКминдальная кислота;ААКα-аминоадипиновая кислота;6-АПК6-аминопенициллановая кислота;7-АЦК7-аминоцефалоспорановая кислота;7-АДЦК7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота;7-ПАЦКL-пропенил-7-АЦК (для формулы II: R2=L-пропенил);МТ-7-АЦК3-(5-метил-1,3,4-тиодиазол-2-ил)-7-АЦК;7-AХЦК7-амино-3-хлороцефем-4-карбоновая кислота;7-АПРА(6R,7R)-7-амино-8-окси-3-(1-пропиенил)-5-тио-1-азабицикло[4.2.0]окто-2-ен-2карбоновая кислота;2-АБ2-аминобутанол;ФАфенилаланинол;8ФФАфенилацетилфенилаланинол;МФАR-манделилфенилаланинол;ОФАo-фталиевый альдегид;R-NMCN-(R)-манделил-(S)-цистеин;РСАрентгеноструктурный анализ;ПЦРполимеразная цепная реакция;dNTPдезоксирибонуклеозид трифосфаты;SDSдодецилсульфат натрия;IPTGизопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозид;ФБфосфатный буфер;э.и.50%расчитанное значение энантиомерного избытка (э.и.) при 50% конверсии;п/грподгруппа;н.а.нет активности;н.д.нет данных;бета-лактамный антибиотик - термин объединяющий все антибиотики, представленныеформулами I (пенициллины) и II (цефалоспорины):IIIwIfIIIгде X=S, O, C или SO2, R1 - боковой радикал, например, остаток ФУК, ФОУК, D-ФГ, П-OHD-ФГА или D-2,5-дигидро-ФГ и их производные, а также ацетил, адипил или глутарил и ихпроизводные, R2 и R3=Cl, алифатический или ароматический радикал, дополнительно может9включать атомы O, S или N, R4 = OH, алифатический или ароматический спирт и возможныепроизводные, дополнительно может включать атомы O, S или N.epPCRerror-prone PCR (склонный к ошибкам ПЦР);SSMsite saturation mutagenesis (сайт-насыщающий мутагенез);CASTcombinatorial active-site saturation test (комбинаторный насыщающий тест поакт.
сайту). Не путать с вариантом названия методики SELEX (сyclicamplification and selection of targets);ISMiterative saturation mutagenesis (итеративный насыщающий мутагенез);ProSARprotein sequence activity relationships (взамосвязь белок-последовательностьактивность).Сокращения, характеризующие изменение свойств мутанта по отношению к ecПА ДТ:ОИотносительное изменение того или иного свойства, зафиксированное в той или инойреакции;ОИконв отношение максимальных степеней превращения (%) β-лактамной части;ОИкат относительное изменение каталитической активности;ОИS/H относительное изменение соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза;ОИinотносительное изменение константы инактивации первого порядка.В скобках приводятся уточнения или особые условия при которых зафиксировано ОИ.Например, «ОИконв=31/30 (ац.донор)», означает что % конверсии рассчитан по расходуацильного донора.
Если не оговорено иное, изменение зафиксировано относительно есПА.10Рассматриваемые реакции, катализируемые ПА:Реакция пG: Гидролиз пенициллина-G с образованием 6-АПК и ФУК;Реакция цG: Гидролиз цефалоспорина-G с образованием 7-АДЦК и ФУК;Реакция цС: Гидролиз цефалоспорина-С с образованием 7-АЦК и ААК;Реакция пV: Гидролиз пенициллина-V с образованием 6-АПК и ФОУК;Реакция 0а: Синтез Пен-G путем ацилирования 6-АПК амидом ФУК;Реакция 1а: Синтез ампициллина путем ацилирования 6-АПК амидом D-ФГ;Реакция 1э: Синтез ампициллина путем ацилирования 6-АПК эфиром D-ФГ;Реакция 2а: Синтез амоксициллина путем ацилирования 6-АПК амидом п-OH-D-ФГ;Реакция 2э: Синтез амоксициллина путем ацилирования 6-АПК эфиром п-OH-D-ФГ;Реакция 3а: Синтез цефалексина путем ацилирования 7-АДЦК амидом D-ФГ;Реакция 3э: Синтез цефалексина путем ацилирования 7-АДЦК эфиром D-ФГ;Реакция 4а: Синтез цефадроксила путем ацилирования 7-АДЦК амидом п-OH-D-ФГ;Реакция 4э: Синтез цефадроксила путем ацилирования 7-АДЦК эфиром п-OH-D-ФГ;Реакция 5а: Синтез цефрадина путем ацилирования 7-АДЦК амидом D-2,5-дФГ;Реакция 5э: Синтез цефрадина путем ацилирования 7-АДЦК эфиром D-2,5-дФГ;Реакция 6э: Синтез цефпродина путем ацилирования 7-ПАЦК эфиром D-ФГ;Реакция 7: Синтез цефалотина путем ациллирования 7-АЦК тиенилуксусной кислотой;Реакция 8: Синтез цефазолина путем ацилирования МТ-7-АЦК эфиром ТЗУ;Реакция 9э: Синтез цефаклора путем ацилирования 7-АХЦК эфиром D-ФГ;Реакция 10э: Синтез цефпрозила путем ацилирования 7-АПРА эфиром п-ОН-D-ФГ;(Эфир метиловый, этиловый, гидроксиэтиловый).11ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы.
Пенициллинацилаза из Escherichia coli (ecПА) широкоиспользуется в фармацевтической промышленности для получения ядер бета-лактамныхантибиотиков путем гидролиза природных пенициллинов и цефалоспоринов. Проводятсяисследования по применению ecПА в качестве катализатора, способного в водной средепроводить энантиоселективное ацилирование аминосоединений и разделение их рацематов,получение полусинтетических антибиотиков, пептидный синтез с участием неприродныхаминокислот, защиту свободных аминогрупп и др. Однако ограниченная субстратнаяспецифичность и стереоспецифичность фермента дикого типа, низкая стабильность вщелочной среде, а также в присутствии высоких концентраций субстратов и осложнениереакций синтеза протеканием побочных реакций гидролиза во многом ограничивают егоболееширокоеприменение.Перспективнымпутемрешенияпроблемыявляетсяиспользование методов белковой инженерии для направленного изменения свойств ферментав зависимости от поставленной задачи.Цель и задачи исследования.
Основной целью исследования являлось обнаружение ихарактеристика мутаций, приводящих к изменению каталитических свойств и стабильностифермента. В связи с этим основными задачами были:анализ и систематизация литературных и патентных данных для установленияструктурно-функциональных взаимосвязей и определения роли ранее проведенныхаминокислотных замен для улучшения свойств фермента дикого типа;определение стратегии и выбор аминокислотных остатков для мутагенеза;получение, выделение и очистка новых мутантных форм фермента для последующейхарактеристики;изучение каталитических свойств и стабильности полученных мутантов ecПА, ихспособности катализировать получение полусинтетических пенициллинов, а такжестереоселективное ацилирование аминоспиртов в водной среде;установлениеосновныхэффектовотвведенныхмутаций,нахождениезакономерностей и корреляций, составление рекомендаций.Научная новизна работы.При выборе стратегии мутагенеза был использованкомплексный подход, основанный на анализе последних представлений о структуре имеханизме действия фермента, молекулярном моделировании и биоинформатике, что12позволило выбрать ранее неизвестные позиции для улучшения свойств фермента дикоготипа.
Получены двадцать семь новых активных мутантных форм ecПА, при систематическомизучении их каталитических свойств и стабильности показано, что направленный мутагенезпозволяет существенно и целенаправленно изменять свойства фермента. Обнаружено, чтовведение мутации bF256R позволяет в 4 раза, а в комбинации с aR145G более чем в 20 разувеличить эффективность ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты в реакции синтезабета-лактамных антибиотиков; введение мутации bF71A приводит к 250-кратномуувеличению стереоселективности в реакции ацилирования ароматических аминоспиртов.Установлено, что солевая триада bR297-bE266-bN262 и карбоксил-карбоксилатная параbE482-bD484 играют существенную роль в поддержании третичной структуры белка.Отталкивание однозарядной пары остатков bE482-bD484 определяет низкую стабильностьecПА дикого типа в щелочной среде.
Обнаружена мутация bD484N, позволяющая сохранитьвзаимодействие между остатками в щелочной среде, что приводит к 9-кратному увеличениюстабильности в щелочной среде, а также в присутствии высоких концентраций субстратовпри пептидном синтезе. Впервые показана возможность замены консервативного дляпенициллинацилаз N-концевого нуклеофильного серина bS1 на треонин с сохранениемкаталитической активности путем введения компенсирующей мутации. Установлены прямыекорреляции между активностью мутантных форм в реакциях гидролиза хромогенногосубстрата и синтеза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективностьюацилирования ароматических и алифатических аминоспиртов.Практическая значимость работы. Оптимизирована и внедрена в лабораторнуюпрактику методика получения генов мутантных форм ecПА.
Создана коллекция, включающая33 новые плазмиды (в том числе 9 получены к.х.н. Ясной А.С.), содержащие гены мутантныхформ ecПА. Получены, выделены и очищены 27 новых активных мутанта ecПА. Показано,что мутант bD484N не только более стабилен в щелочной среде, но и существенно болееустойчив к инактивации при высоких концентрациях субстратов, что расширяет границыприменимости фермента в препаративном пептидном синтезе.
Препараты на основе мутацииbF256R характеризуются более чем 4-кратным улучшением эффективности ацильногопереноса, что может найти свое применение в препаративном биокаталитическом полученииполусинтетическихантибиотиков.СтереоселективностьмутантаbF71AкS-фенилацетилфенилаланинолу превышает стереоселективность ecПА дикого типа более чемна 2 порядка, что позволяет провести биокаталитическое разделение рацемата аминоспирта и13получитьиндивидуальные энантиомеры высокойоптической чистоты. Разработанопрограммное обеспечение, позволяющее моделировать протекание биокаталитическихреакций при варьировании начальных концентраций реагентов и эффективных кинетическихпараметров.Апробация работы.
Основные положения и результаты работы были представленны назимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химическойбиологии и биотехнологии» (2014 г., Москва, ИБХ, лауреат I премии), международномконгрессе «FEBS-2013» (2013, Санкт-Петербург), международных конференциях «ProteinStabilization» (2014, Италия), «Enzyme Engineering XXII» (2013, Япония), «BioTrans-2013»(2013, Англия), «Biocatalysis-2013» (2013, Москва), «BioTrans» (2011, Италия), российскомсимпозиуме «Белки и пептиды» (2011, Петрозаводск).Публикации. По материалам диссертации подготовлены и опубликованы 4 статьи врецензируемых научных журналах, получен 1 патент, поданы 2 заявки на изобретение,представлены 11 тезисов докладов международных конференций.Структура и объем работы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
