Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение»,«Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Основныерезультаты и выводы», «Список литературы», «Приложения». Объем диссертации составляет201 страница машинописного текста (в том числе 20 страниц приложений) и включает 76рисунков, 67 таблиц, 2 диаграммы, 5 схем и 153 библиографические ссылки.141 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР1.1 Пенициллинацилаза1.1.1 Общие сведенияПенициллинацилаза (ПА, КФ 3.5.1.11) относится к классу гидролаз, подклассуамидогидролаз и, в основном, известна как катализатор гидролиза амидной связи вантибиотикахпенициллиновогоряда.ПАширокораспространенывразличныхмикроорганизмах, включая бактерии, грибы и дрожжи.
В настоящее время наиболееизученной является ПА из Escherichia coli (ecПА).1.1.1.1 Физиологическая роль ПАВработах[12–15],посвященныхвтойилиинойстепенипрояснениюфизиологической роли ПА, было установлено, что ФУК, способная выступать в качествеединственногоисточникатранскрипционномуглерода,индуцируетактивностьПАвклеткахнауровне. Наряду с этим ген ПА (PAC) обладает некоторымирегуляторными особенностями, свойственными многим генам, принимающим участие вметаболизме углерода. Учитывая подобные факты, в качестве рабочей гипотезы принимаетсяпредположение, что ПА вовлечена в ассимиляцию ароматических соединений - источниковуглерода у непаразитических организмов [16].
Roa A. c соавторами приписали ПА рольмолекулярного«дворника»,трансформирующегонеметаболизируемыефенилацетилированные субстраты в метаболизируемые [17]. Однако, к сожалению,современные комплексные работы по данной тематике отсутствуют, и вопрос о роли ПА invivo до сих пор остается открытым.1.1.1.2 Каталитическая активностьВпервые гидролитическая активность ПА была обнаружена японскими учеными в1950 г. [18]. ПА катализирует реакцию гидролиза Пен-G c образованием 6-АПК и ФУК(рис.1)15HNSПАOH+NONOCOOHOSH2NOCOOHРис 1. Ферментативный гидролиз Пен-G, катализируемый ПА.Уникальность свойств ПА заключается в том, что фермент избирательно катализируетрасщепление амидной связи в боковой цепи Пен-G, не затрагивая более лабильнуюлактамную связь.
Это преимущество фермента нашло широкое применение при полученииядер бета-лактамных антибиотиков (6-АПК, 7-АДЦК) из природных пенициллинов. Следуетособо отметить, что катализ ПА происходит в исключительно мягких условиях в воднойсреде. Температурный оптимум лежит в диапазоне 35-38 °С, pH оптимум приходится на 7,68,5 [19; 20].Синтетическая активность ПА была обнаружена 10 лет спустя в 1960 г. [21; 22].Авторы продемонстрировали возможность получения Пен-G обратно из 6-АПК и ФУК.СинтетическиеспособностиПАоткрываютпутьдляполученияцелогорядаполусинтетических бета-лактамных антибиотиков (см. п.
1.1.2.1, а также реакции на стр.910). Принципиальным отличием реакции гидролиза пенициллинов и цефалоспориновявляется ее обратимость, что делает возможным препаративный биокаталитический синтезновых так называемых полусинтетических аналогов в водной среде [23].1.1.1.3 Субстратная специфичностьСубстратная специфичность ecПА (класс IIa, согласно [24]) главным образомопределяется строением ацильной части (рис.2).
Наиболее специфичными субстратамиявляются эфиры и амиды ФУК, в том числе Пен-G (kcat = 39-50 с-1, KM = 5-10 мкМ, рис. 2),который до появления работы [25] считался наиболее реакционоспособным субстратом. Водной из ранних работ [26] авторы предложили ферменту название «фенилацетилаза».16Рисунок 2. Субстратная специфичность ecПА.Субстратная специфичность ПА к ацильной части строго ограничена и допускаетвозможность присутствия лишь небольших заместителей в Сα положении фенилацетильнойчасти или в ароматическом кольце.
Марголин А.Л., Швядас В.К. и Березин И.В. в работе [27]показали, что, в то время как kcat гидролиза фенилацетильных производных и производных DФГ отличаются в незначительной мере, значения KM в случае производных D-ФГ примернона 2 порядка выше, чем в случае соответствующих фенилацетильных производных. Ферментне способен связывать ацильный остаток, содержащий протонированную аминогруппу.Специфичность ПА к амидной части широкая – ферментативный гидролиз N-ацильныхпроизводных широкого круга аминосоединений, в том числе аминокислот, олигопептидов,сахаров и нуклеозидов, протекает эффективно. Было также обнаружено, что при переходе отПен-G к фенилацетильным производным некоторых аминокислот и фенилацетиланилидовkcat также меняется слабо, и в большинстве случаев значительно повышается значение KM17[27].
Высокая специфичность к фенилацетильной части позволяет использовать такие«цветные» субстраты как NIPAB для определения активности препаратов фермента разнойстепени очистки [28; 29]. Тем не менее изменение структуры уходящей группы может сильносказываться и на значении kcat: при переходе от цефалексина к п-нитроанилиду D-ФГкаталитическая константа уменьшается в 100 раз при том, что значение KM одинаково длядвух субстратов.1.1.1.4 СтереоспецифичностьПервые указания на энантиоизбирательность ПА были получены при проведениигидролиза фенилацетильных производных альфа-аминокислот.
Cole M. показал, что Lэнантиомеры фенилацетильных производных аминокислот гидролизуются ecПА быстрее,чем соответствующие D-формы субстрата [26]. Значение стереоспецифичности гидролизафенилацетильных производных альфа-аминокислот достигает значений от нескольких сотендо нескольких тысяч в зависимости от структуры бокового радикала аминокислоты [25; 30].ГораздоменееэффективноecПАразличаетэнантиомерыацильныхпроизводныхнефункционализированных аминов и соединений, содержащих спиртовую группу.Галунский Б. с соавторами изучили стереоспецифичность ПА из разных источниковпо отношению к ряду субстратов, представляющих практический интерес [31]. Былопоказано, что при наличии хирального центра в ацильной части субстрата наблюдаетсяизбирательное превращение R-форм, а в случае наличия хирального центра в амидной части– S-форм (рис.3).18Рис.3 Стереоселективность ПА из различных источников по отношению к субстратам,содержащим хиральный центр в ацильной и амидной частях субстрата.1.1.2 Основные области применения ПА1.1.2.1 Получение бета-лактамных антибиотиковВ настоящее время для получения полусинтетических бета-лактамных антибиотиковшироко используют методы тонкого органического синтеза – синтез из хлорида D-ФГ•HCl поШоттен-Бауману (рис.4 слева) и синтез через образование соли Дана и смешанногоангидрида (рис.4 справа).Рис.4 Химический синтез ампициллина по Шоттен-Бауману (слева) и по Дану(справа).19Как видно из рис.4, многостадийный химический синтез требует введения защитныхгрупп,использованиягалогенированногорастворителя,пониженныхтемпературисопровождается большим числом побочных продуктов.
Несмотря на это, еще 10 лет назад ухимического синтеза не было реальной экономически оправданной альтернативы.Разработкой одностадийного биокаталитического синтеза при помощи ПА занималисьмногие научные коллективы, начиная с открытия в 60-х годах прошлого века синтетическихспособностей фермента [22; 23; 32–36]. Опытное биокаталитическое производствоцефалексина было организовано в СССР на Рижском заводе медицинских препаратов всередине 80-ых годов. В 2004 г. компания DSM (Нидерланды) анонсировала открытиемасштабного производства «ферментативного» цефалексина, цефадроксила и амоксициллина[37].ИспользованиеиммобилизованныхпрепаратовПАпозволяетпроизводитьодностадийный ферментативный синтез в исключительно мягких условиях в водной среде.Ферментативный синтез бета-лактамных антибиотиков, как, впрочем, любых амидов,можно проводить в термодинамически (обратный гидролиз) и кинетически контролируемыхрежимах (рис.5).Рисунок 5.
Упрощенные кинетические схемы и кривые накопления антибиотика (P)для катализируемого ПА (E) термодинамически и кинетически контролируемого синтеза. A –свободная аминокислота, AD – активированное производное аминоксислоты, N – беталактамный нуклеофил, EA – ацил-фермент, Q – уходящая группа.20В первом случае при прямой конденсации производных ФУК (A) и бета-лактамногоядра (N) максимальный выход продукта равен равновесному, определяется константойравновесия и не зависит от свойств фермента:[ P] макс .
[ P] равн. [ A][ N ].K P [ H 2 O]Данный подход может быть с успехом реализован при использовании ФУК илитиенилуксусной кислоты в качестве донора ацильной части для синтеза Пен-G и цефалотина[22; 35; 38], однако, не подходит для синтеза антибиотиков, содержащих аминогруппу вбоковой цепи (ампициллина, амоксициллина, цефалексина и др.) из-за цвиттерионнойприроды ацильного донора (ФГ, п-OH-ФГ) в широком диапазоне pH .В кинетически контролируемом режиме, когда происходит перенос ацильной группыот активированного донора (сложных эфиров, амидов, N- ацилированных аминокислот),максимально достижимая концентрация продукта обычно превышает равновесную (рис.5),что делает данный подход более привлекательным. Экспериментальные исследованиякинетики реакции ацильного переноса показывают, что реакция описывается схемой 1 [39]:E + SKsESk2EAk3E+P2+P1Nk5KnEANk4KpEPE+Pk-4Схема 1.
«Минимальная» кинетическая схема ферментативного переноса ацильнойгруппы на нуклеофил. E – свободный фермент, S – активированный донор ацильной части, P1– продукт гидролиза донора, P2 – продукт гидролиза ацилферментного комплекса, N –нуклеофил, P – целевой продукт, ES – фермент-субстратный комплекс, EA – ацилфермент,EP – комплекс фермент-продукт, EAN –ацилфермент-нуклеофильный комплекс.21Процесс протекает через последовательное образование ацилферментного (EA) иацилфермент-нуклеофильного комплекса (EAN), который в свою очередь подвергаетсятрансформации и приводит к образованию продукта (P). В теоретических работах [39–41] покинетике ацильного переноса, катализируемого ферментами, действующими по даннойсхеме, показано, что при фиксированных начальных концентрациях ацильного донора (S0) инуклеофила (N0) максимальный выход целевого продукта зависит только от значений трехключевых параметров:-параметра=(k-4/KP)/(k2/KS),характеризующегоотносительнуюспецифичностьфермента по отношению к продукту (P) и исходному ацильному донору (S).-параметра =k4/(k3·KN), характеризующего относительную реакционную способностьнуклеофила (N),-параметра =k5/k4, характеризующего способностьтройного комплексаEANпревращаться по гидролитическому или синтетическому пути.Конкурирующие реакции непродуктивного гидролиза ацильного донора (k3) иобразующегося антибиотика (k-4) – основные недостатки кинетически контролируемогосинтеза бета-лактамных антибиотиков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
