Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Затем реакционные смеси объединяли, вновь добавляли 0,25 мклсмеси высокоточных ДНК-полимераз и проводили 18 циклов нагревания – охлаждения.Проведение рестрикции матричной цепиПосле амплификации 10 мкл реакционой смеси инкубировали с 1 мкл рестриктазыDpnI (FastDigest® DpnI, Fermentas) в общем объеме 20 мкл при 37°С в течение 0,5 часа.Трансформация и клонированиеК 50 мкл компетентных клеток E.coli TG-1 (в некоторых случаях XL1-Blue)добавляли 10 мкл рестрикционной смеси и выдерживали во льду в течение 0,5 часа.
Тепловойшок проводили при инкубировании смеси в течение 1,5 мин при 42°С, с последующим73охлаждением во льду в течение 2 мин. Затем добавляли 250 мкл LB среды и инкубировали нашейкере при 37°С в течение 0,5 часа. Далее 100 мкл клеток растирали на агаризованныхчашках Петри, содержавших хлорамфеникол в концентрации 68 мг/л. Не менее чем черезсутки 3 клона переносили в пробирки с 2 мл LB среды, содержавшей хлорамфеникол вконцентрации 68 мг/л. Пробирки инкубировали в течение ночи при 37°С при перемешиваниина скорости 200 об/мин. Затем ночные культуры разделяли на две части.
Первую частьиспользовали для наработки (170 мг/л хлорамфеникол, 10-12 часов), выделения (GeneJET™Plasmid Miniprep Kit, Fermentas) и секвенирования плазмиды (сервис компании «Евроген»).Вторую часть оставляли для экспрессии, выделения и очистки пенициллинацилазы.2.2.2 ПЦР мутагенез с перекрываниемПроведение полимеразной цепной реакции [113; 114]Соответствующие праймеры с концентрацией 1,25 пмоль/мкл добавляли к плазмиде,содержащей модифицируемый ген, с концентрацией 1 нг/мкл в присутствии 2,5 мМ dNTP и10-кратного полимеразного буфера.
Объем реакционной смеси составлял 30 мкл. Затем впробирку добавляли масло и смесь прогревали 3 минуты без ДНК-полимеразы при 95°C.После чего в реакционную смесь добавляли 1 мкл ДНК-полимеразы (2,5 ед/мкл) и проводили25 циклов нагревания – охлаждения при следующих условиях: 1 мин при 95°С, 1 мин при59°С (температура отжига варьировалась в зависимости от праймеров, используемых вреакции), 1 мин при 72°С.Рестрикция фрагментов ДНКРестрикцию фрагментов ДНК проводили в течение 1-2 час в соответствующембуфере при 37°С в суммарном объеме 20 мкл.
Для гидролиза фрагментов ДНК (200 нг/мкл)добавляли 2-4 ед. рестриктазы. Рестриктазы добавляли в два этапа. Половину отиспользуемого количества рестриктаз вносили в реакцию сразу, а вторую половину - через 45мин после начала протекания реакции, что обеспечивало исчерпывающий гидролизфрагментов. Полноту рестрикции контролировали при помощи электрофореза в 1%агарозном геле.Рестрикция плазмидной ДНКРестрикцию плазмидной ДНК (300 нг/мкл) проводили в течение 1-2 часов вприсутствии 2-4 ед рестриктазы в соответствующем буфере при 37°С в суммарном объеме 20мкл. Полноту протекания реакции контролировали при помощи электрофореза.
Выделение74рестрикционных фрагментов: Фрагменты ДНК, полученные после рестрикции, разделялиэлектрофорезом в 1% агарозном геле. Нужный фрагмент вырезали из геля при освещениидлинноволновым ультрафиолетом (365 нм). Дальнейшее выделение ДНК проводили спомощью соответствующего набора реагентов по методике фирмы-производителя.Лигирование фрагментов ДНКЛигирование фрагментов ДНК проводили с помощью Т4 ДНК-полимеразы пометодикефирмы-производителя.вставляемогофрагментаСоотношениесоставляло1:3.расщепленнойПолученнойвекторнойлигазнойсмесьюДНК(5имкл)трансформировали компетентные клетки E.coli XL1-Blue.2.2.3 Наработка биомассыНаработку биомассы клеток E.coli TG-1 с ПА проводили при 15°С в течение 50-60 ч вкачалочных колбах на 500 мл с отбойниками.
Объем колбы содержал 50 мл среды 2YT (16 г/лтриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl, рН 7,5) или YE (7,5 г/л дрожжевогоэкстракта, рН 7,5) с хлорамфениколом в концентрации 68 мкг/мл. Дополнительно вкультуральную среду вносили CaCl2 (2 мМ) и глицерин (5 г/л). В качестве индукторабиосинтеза ПА использовали IPTG с конечной концентрацией 0,1 мМ. Индукцию начиналипри достижении А600 = 0,6-0,8.2.2.4 Выделение и очистка мутантных препаратов ПАРазрушение клеток при помощи ультразвука1,5 мл суспензии клеток осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 5000об/мин. Ресуспензировали в 1/10 буфера Л (0,05 М ФБ, pH 7,5, 0,1 мг/мл лизоцима).Замораживали 5 мин в морозильной камере при -70°С.
Размораживали при комнатнойтемпературе. Дезинтегрировали 15 мин на ультразвуковой бане при 20 кГц и 160 Вт врежиме: 1 мин. ВКЛ/1 мин. ВЫКЛ. Центрифугировали в течение 2 мин при 14000 об/мин.Измеряли специфическую активность в супернатанте.Выделение при помощи осмотического шокаКлетки осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 3500 об./мин и 4°С.Супернатант отделяли и осадок ресуспендировали в 1/10 объёма осмотического шокового75буфера А (20% сахароза, 0,1 М Tрис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0), охлаждённого до 0°С, ицентрифугировали 10 минут при 7000 об./мин и 4°С. Супернатант отделяли и осадокресуспендировали в 1/10 объёма осмотического шокового буфера В (1 мМ ЭДТА, рН 8,0)охлаждённого до 0°С, и центрифугировали 15 минут при 9000 об/мин и 4°С.
К полученномусупернатанту добавляли 1 М ФБ pH 7,0, до конечной концентрации 0,05 М (Раствор 1).Очистка в градиенте сульфата аммонияК раствору 1 добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 1,5 М. Затем на15 мин ставили раствор на качалку для формирования осадка. Центрифугировали раствор 15мин при 12000 об/мин. К супернатанту добавляли охлажденный раствор сульфата аммониядо концентрации 2,9 М. На 15 мин оставляли раствор на качалке.
Центрифугировали раствор15 мин при 12000 об/мин. Ресуспензировали осадок в 10 мл буфера 2 (0,05 М ФБ, 0,02 %NaN3, pH 7,5). Затем концентрировали и обессоливали в центрифужных концентраторахMillipore 30 кДа 2 раза по 10 мин при 4000 об/мин. Все процедуры проводили приохлаждении (центрифужный термостат, ледяная баня).Очистка при помощи гидрофобной хроматографииК раствору 1 добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 1,5 М. Далее,наносили образцы на колонку с Бутил-тойоперл 650M, уравновешенную буфером 1 (0,05 МФБ, 1,5 М (NH4)2SO4, 0,02% NaN3, pH 7,5) и элюировали в линейном градиенте 1,5-0 М(NH4)2SO4 при использовании буфера 2 (0,05М ФБ, 0,02% NaN3, pH 7,5).
Ферментэлюировалсяприконцентрации(NH4)2SO4равной1М.Фракции,обладающиепенициллинацилазной активностью, объединяли, обессоливали на колонке HiTrap Desalting иконцентрировали в ячейке для ультрафильтрации с использованием мембраны Millipore на 30кДа.К полученным препаратам добавляли глицерин до 10% и оставляли в холодильникепри +4°С, если ферментный препарат использовался для дальнейших исследований, или вморозильной камере при -20°С, если было необходимо длительное хранение препарата.2.2.5 Приготовление компетентных клетокОдну колонию E.coli TG-1 переносили в 2,5 мл LB среды и инкубировали ночь при37°С.
Весь объем ночной культуры переносили в 250 мл LB среды, добавляли MgSO4 до76концентрации 20 мМ и подращивали до оптической плотности OD600=0,4-0,6 (обычно 5-6часов). Затем центрифугировали клетки при 4500 g 5 мин при охлаждении до 4°С. Аккуратноресуспендировали осадок охлажденным раствором TFB1 (40% от исходного объема, 30 мМCH3COOK, 10 мМ CaCl2, 50 мМ MnCl2, 100 мМ RbCl, 15% глицерин, pH 5,8,стерилизованный через 0,2 мкм фильтр) и оставляли на холоду (+4°С) в течение 5 мин. Затемснова центрифугировали клетки в том же режиме и аккуратно ресуспендировали осадокохлажденным раствором TFB2 (4% от исходного объема, 100 мМ MOPS, 75 мМ CaCl2, 10 мМRbCl, 15% глицерин, pH 6,5, стерилизованный через 0,2 мкм фильтр).
Инкубировали клеткиво льду в течение 15-60 мин, разделяли на аликвоты по 100 мкл и замораживали при -70°С.Все операции совершали на холоду, предварительно охлаждая все емкости и пипетки.2.2.6 Электрофорез в агарозном гелеЭлектрофорез молекул ДНК проводили в TAE буфере (40 мМ Трис, 20 мМCH3COOH, 1 мМ ЭДТА) в 1% агарозном геле. Для окрашивания образцов использовалиTriTrack™, в составе которого имеется 3 красителя (бромфеноловый синий, ксилен циановыйФФ, оранжевый Ж), мигрирующих с разными скоростями. В качестве маркеровмолекулярного веса использовали набор FastRuler™ (5000-100 Да, 4 нг/мкл), дляаналитических целей использовали набор MassRuler™ (10000-100 Да, 1-10 нг/мкл).Окрашивание геля проводили в растворе бромистого этидия с концентрацией 0,5 мкг/мл.Визуализировали полосы при 254 нм. В качестве альтернативы использовали менеечувствительный (при 254 нм), но более безопасный (по результатам исследований фирмыпроизводителя [115]) краситель Sybr® Safe.2.2.7 Электрофорез в полиакриламидном гелеДенатурирующий SDS-электрофорез для разделения белков по Лэммли проводили прииспользовании следующих растворов:1.
Акриламид/бисакриламид (30%T, 2,67%C)2. 10% SDS3. Буфер 1: 1,5 М Трис-HCl, pH 8,84. Буфер 2: 0,5 М, Трис-HCl, pH 6,877Состав гелей: Разделяющий 12% гель: 3,4 мл H2O дист., 4,0 мл раствора 1, 2,5 млраствора 3, 0,1 мл раствора 2. Концентрирующий 6% гель: 5,4 мл H2O дист., 2,0 млраствора 1, 2,5 мл раствора 4, 0,1 мл раствора 2.Для инициации полимеризации непосредственно перед заливкой геля к 10 мл растворамономеров добавляли 50 мкл 10% персульфата аммония и 5 мкл ТЕМЕД.Состав буфера для нанесения пробы (восстанавливающий буфер с SDS):1.
H2O дист. - 3,55 мл2. 0.5 М Трис-HCl, pH 6,8 - 1,25 мл3. Глицерин - 2,5 мл4. 10% SDS - 2,0 мл5. 0,5% бромфеноловый синий - 0,2 мл50 мкл βМЭ добавляли к 950 мкл буфера для нанесения пробы. Разводили образецбуфером для нанесения в пропорции по меньшей мере 1:2 и прогревали при 95°С в течение 4мин.В качестве маркера использовали смесь Prestained Protein Molecular Weight Marker,содержащую набор следующих белков: β-галактозидаза (118 кДа), бычий альбумин (90 кДа),овальбумин (43 кДа), карбоангидраза (34 кДа), β-лактоглобулин (26 кДа), лизоцим (19 кДа).Электрофорез проводили при 15 мА для концентрирующих условий и при 30 мА дляразделяющих на протяжении 45-60 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
