Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 15
Текст из файла (страница 15)
В среднемНедостатки70% - для одиночных мутантов, 20%- для двойных мутантов.- использование 4-х праймеров;- оптимизация условий ПЦР для каждой новойпары праймеров;- необходимость использованияспецифических эндонуклеаз рестрикции;- необходимость выделения продуктовамплификации гена;- необходимость использования ферментовлигирования;- длительность (3-4 суток до полученияклонов с мутациями).На наш взгляд, в рутинных и скриннинговых экспериментах для полученияодиночных и двойных мутантов ПА следует отдавать предпочтение быстрому, дешевому ипростому методу QuikChange ПЦР мутагенеза. Однако, необходимо подтверждать вводимыемутации с помощью секвенирования, не менее чем для трех клонов, и доказывать отсутствие95возможных ошибок на протяжении всего гена. При проведении полного секвенирования спяти праймеров для трех случайным образом выбранных плазмид, полученных по методикеQuikChange, нами были обнаружены немногочисленные равнозначные замены и 2 заменыAla->Thr.
В одном случае это была замена в незначимой области межсубъединичногоспейсера, в другом – в значимой части далеко от активного центра. Следует отметить, что нарынке полимераз появилась полимераза Q5 (New England Biolabs), которая обеспечиваетточность на порядок большую по сравнению с Pfu, что делает QuikChange ПЦР мутагенезеще более привлекательным.В случаях, когда необходима высокая точность, и под рукой нет высокоточныхполимераз,предпочтительнееиспользоватьклассическийметодПЦР-мутагенезасперекрыванием. Для одновременного получения многоточечных мутантов этот метод вмодификации [114] также представляется более эффективным.3.3 Экспрессия, выделение и очисткаВ качестве экспрессионной плазмиды использовали вектор на основе плазмидыpBR322 (4562 п.н.), содержащий ген ecПА (PAC, 2541 п.н.), а также ген устойчивости кхлорамфениколу (CmR, рис.32).Рисунок 32. Рестрикционная карта вектора на основе pBR322.96Расстояние от последовательности Шайна-Дальгарно до AUG кодона в PAC меньшесреднего, что приводит к затруднениям в системе трансляции-транспорта, заключающимся внесоответствии скоростей обоих процессов, и, как следствие, к накоплению неполноценногобелка при повышенных температурах.
В связи с этим экспрессию ПА следует проводить припониженных температурах [116]. В настоящей работе экспрессию генов мутантных форм ПАосуществляли при 15°С в клетках E.Сoli штамма TG-1 в течение 48-56 часов. Принимая вовнимание рекомендации работы [113], в культуральную среду дополнительно вносили CaCl2в концентрации 2мМ и глицерин в концентрации 5 г/л. В качестве индуктора биосинтеза ПАиспользовали IPTG. В ходе культивирования констатировали прирост плотности клеточнойбиомассы и увеличение специфической активности по NIPAB в клеточном лизате (рис.33,здесь и далее на примере мутанта bF256R+bF71L).
Культивирование прекращали при4,543,532,521,510,501,210,80,60,40,2dA/dt 400 нм, o.e./минOD 600 нм, o.e.достижении высокого уровня пенициллинацилазной активности.01520253035404550время, часРисунок 33. Прирост оптической плотности при 600 нм для клеток с bF256R+bF71L(прерывистая линия) и активность клеточного лизата в реакции ферментативного гидролизаNIPAB (сплошная линия).Известно, что большинство изученных ПА транспортируется в периплазматическоепространство [117]. В связи с этим клетки, содержащие ecПА, полученные на предыдущейстадии, осаждали и выделяли периплазматический экстракт методом осмотического шока вградиенте сахарозы. Выход рассматриваемого белка на этой стадии составил 24 мг/л среды.ПослеочисткигидрофобнойхроматографиейнаносителеButyl-Toyopearl650M,обессоливания и концентрирования был получен препарат с выходом 20 мг/л среды.
Фактор97очистки, характеризуемый отношением специфических активностей по NIPAB в пересчете наобщий белок для очищенного препарата и периплазматического экстракта, составил значение7. Очищенные препараты полученных мутантов анализировали с помощью электрофореза вПААГ (рис.34).Рисунок 34. 12% SDS-ПААГ электрофорез препаратов ecПА ДТ (1 дорожка коммерческий препарат) и очищенных мутантных форм (2 – bS149R, 3 – bF256R+bF71L, 4 –bA255R+bF71L, 5 – bN388Q).Две характерные полосы в области 23 и 63 кДа соответствуют a- и b-субъединицамбелка, что свидетельствует о завершенных стадиях автокаталитического созревания.3.4 Титрование активных центров, каталитическая активность и термостабильностьПредварительный эксперимент по титрованию активных центров показал, чтоинактивация полученных мутантных форм фермента под действием необратимогоингибитора сериновых протеаз - ФМСФ протекает так же эффективно как и инактивацияecПА ДТ [58], и прирост остаточной активности в ходе эксперимента происходит не более,чем на 1%.98OOSFOРисунок 35.
Структура ФМСФ (слева) и титрование активных центров ПА на примереβA255R+bF71L (справа).Концентрацию активных центров ПА рассчитывали методом линейной регрессии,экстраполируя значение концентрации ингибитора до нулевого значения начальной скоростигидролиза NIPAB (рис. 35).КинетическиепараметрыферментативногогидролизаNIPABизучалиспектрофотометрически, детектируя накопление продукта гидролиза - м-карбокси-пнитроанилина, интенсивно поглощающего при длине волны 400 нм:OHNCOO-H2NCOO-ПАNO2NO2λ = 400 нм, ε = 9600 о.е./МДля определения каталитической константы kcat и константы Михаэлиса KMанализировали зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза от концентрацииNIPAB в прямых координатах (рис.36).99Рисунок 36. Зависимость начальной скорости (V0) от концентрации NIPAB (S0) напримере bN388Q+bF71L.Согласно [118] термическая денатурация ПА представляет собой необратимыйпроцесс, который может быть описан следующей схемой:anbn <=> aubn → au + bd → 1/m(bd)mНа первой стадии происходит обратимая потеря структуры a-субъединицы, чтоактивирует вторую стадию – диссоциацию субъединиц и денатурацию b-цепи.
Эта стадиянеобратима и кинетически контролируема. Третья стадия – агрегация и выпадение в осадокденатурированнойb-субъединицы.Такимобразом,согласноданноймодели,представляющей собой детализированное представление модели Ламри-Эйринга [119],необратимая денатурация является реакцией первого порядка и может быть описанафункцией: A / A0 e kin t , где kin – константа инактивации первого порядка (рис.37).100Остаточная активность A/Ao1y = e-0,076x0,80,60,40,200510152025Время, минРисунок 37.
Термостабильность мутантной формы bN388Q при 50°С и pH 7,5.Кинетические параметры гидролиза NIPAB для всех мутантов, полученных в работе, атакже данные по термо- и pH-стабильности представлены в таблице 27.Таблица 27. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутантных препаратов.СтабильностьNIPABФерментkcat, c-1KM, µMkcat/KMтермощелочнаяecПА ДТ28,0±0,623,1±0,81,2--bF71L50±210±15,0--aS149R31±125,0±0,71,3-bN388Q12,9±0,611,2±0,61,2---bF256R13,7±0,427,0±0,80,5---bF24A2,7±0,2486±190,006-bQ292R21,9±0,725±30,9---bR297A29±122,3±0,81,3-----bD484N19,5±0,914,8±0,51,3-+++101bD484H22,6±(0,9)14,9±(0,5)1,5--bI329E27,0±0,320,0±0,11,4--bS1Tн.а.н.а.н.а.н.а.aT68S3,3±(0,2)10,4±(0,5)0,3-aT68S+bS1T34,5±(1,7)19,8±(1,0)1,7-bS1Cн.а.н.а.н.а.н.а.bQ292R+bI329E18,4±0,318±11,0-bW500C29,6±0,420,7±0,91,4--bM485Rн.а.н.а.н.а.н.а.bR533Cн.а.н.а.н.а.н.а.bR533C+bM485Rн.а.н.а.н.а.н.а.bR533C+bW500C20,6±0,518±11,1--bR533C+bW500C+bM485R26,3±0,521±11,3----bA255R+bF71L52±25,4±0,59,7--bF256R+bF71L18,4±0,97,2±0,62,6--bN388Q+bF71L40±27,8±0,55,2---bF24A+bF71L15±355±50,27--bF256R+bS149R23,7±0,767±20,4---bF256R+bN388Q+bF71L39,4±0,85,6±0,57,1---bF24A+bF71L+bF256R12±245±30,26---bL220E17,0±0,421±10,8-----102bF71A21±29±11,7--bI177V9,2±0,351±20,18+bW154F13,7±0,583±30,16-aR145G+bF256R0,60±0,0117±10,04---Для параметра ОИin: +++ >5, ++ 5-2, + 2-1, - 1-0,4, -- 0,4-0,1, --- <0,1.3.5 Эффективность синтеза3.5.1 Определение параметров α,β,γНаиболее простым количественным путем изучения того, какой эффект оказываетвведение мутации на способность фермента катализировать синтез антибиотика, было быопределение константы связывания нуклеофила с соответствующим ацилферментом.
Однакопрямое экспериментальное определение величины константы связывания нуклеофила непредставляетсявозможным.Удобнойколичественноймерой,характеризующейсинтетические свойства фермента в таких реакциях, является соотношение экспериментальноизмеренных начальных скоростей синтеза и гидролиза S/H (рис. 38).3,5E-040,0045АБ3,0E-040,00352,5E-040,003Vo, М/минконцентрация, М0,0040,00250,0020,00152,0E-041,5E-041,0E-040,0015,0E-050,0005001020304050607080901000,0E+00время, мин0501006-АПК, мМ150200Рисунок 38. А: Накопление продукта синтеза (сплошная) и гидролиза (пунктир) дляbF256R+bF71L.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
