Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Стереоселективность и каталитическая активность есПА ДТ и мутантов вреакции гидролиза ФФА.ФФАФерментV0/E0, с-1ESэ.и.50%ДТ0,83,5±0,555%aS149R0,252,9±0,348%bN388Q+bF71L0,118,5±0,5(R)90%Следует отметить, что оптическая чистота коммерческого препарата (R)-2-АБварьирует от 95% до 97% в зависимости от производителя. Так, компания «Sigma-Aldrich»выпускает препарат с э.и. 96% (CAS №5856-63-3).
Отдельные энантиомеры ФА тот жепроизводительпредлагаетсэ.и.>99%.Такимобразом,дляполученияаналоговкоммерческого оптически чистого 2-АБ теоретически могут быть использованы мутантныеформыПАbF71A,bF71L,bN388Q+bF71L,bF256R+bF71L,bA255R+bF71L,bF256R+bN388Q+bF71L, а для получения аналогов ФА форма bF71A.1153.7 Анализ экспериментальных данных24Диаграмма 2. Сводная диаграмма мутантов ecПА с измененными каталитическими свойствами.На диаграмме 2 отражены относительные изменения (ось ординат) различныхкаталитических свойств (левая ось абсцисс) мутантных форм ecПА (правая ось абсцисс) посравнению с ecПА ДТ. Для наглядности картины ось ординат ограничена 20-кратнымувеличением свойств, при этом значения больших эффектов приведены сверху столбцов.
Полевой оси абсцисс по порядку приведены следующие параметры: NIPAB – kcat/KM в реакциигидролиза NIPAB; 1/α, β, 1/γ – эффективные кинетические параметры в реакции синтезаампициллина или амоксициллина; V0, SH, E – каталитическая активность, S/H истереоселективность в реакциях синтеза 2-АБ и ФА. Мутации, по которым не проводилосьизучение каталитических свойств в реакциях синтеза на диаграмме не представлены.Средивсегонабораэкспериментальныхданныхпредставляетсявозможнымустановить три типа возможных корреляций, согласуясь с соответствием размерностейсопоставляемых данных и их логической взаимосвязи. Первый возможный тип корреляции –взаимоотношение каталитической активности в реакции гидролиза NIPAB c каталитическойактивностью в реакции ацилирования аминоспиртов.
Если сравнивать относительныеизменения данных параметров, то возможно установить следующий вид корреляции (рис.46):8,00ОИ кат. (аминоспирт)7,00R² = 0,51866,00R² = 0,73455,004,003,002,001,000,000,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00ОИ кат. (NIPAB)Риунок46.Корреляциимеждуотносительнымизменениемкаталитическойактивности (kcat/KM) в реакции гидролиза NIPAB и V0/E0 в реакции ацилированияаминоспиртов (▲-2-АБ ● - ФА) для мутантных форм ecПА.
Исключены формы, содержащиемутацию bF24A.Как видно из рисунка 45, для обоих аминоспиртов устанавливается прямаязависимость скорости реакции ацилирования от каталитической активности в реакциигидролиза цветного субстрата. Что особенно интересно, угол наклона в обоих случаяхполучился одинаковым, что может свидетельствовать о независимости относительногоизменения скорости реакции от природы аминоспирта. Однако для подтверждения этойгипотезы необходимо провести ряд уточняющих экспериментов как с различныминуклеофилами, так и с большим числом мутантов (для увеличения выборки).
Интересентакже факт, что тангенс угла наклона составляет величину меньше 1 (приблизительно 0,6),что говорит о большей чувствительности каталитической активности в реакции гидролизаNIPAB к вводимой мутации по сравнению с реакцией синтеза.Второй возможный тип корреляции – взаимоотношение синтетических способностейфермента (S/H или β) в реакциях с 6-АПК (синтез ампициллина) и аминоспиртами. Еслисравнивать относительные изменения данных параметров, то на лицо отсутствие каких-либозакономерностей (рис. 47):30,00ОИ S/H (аминоспирт)25,0020,0015,00R² = 0,04510,005,00R² = 0,33940,000,001,002,003,004,005,006,00ОИ β (ампициллин)Рисунок 47. Корреляции между относительным изменением параметра β в реакциисинтеза ампициллина и S/H в реакции ацилирования аминоспиртов (▲-2-АБ ● - ФА) длямутантных форм ecПА.
Исключены формы, содержащие мутацию bF24A.Отсутствие корреляций можно объяснить разной природой нуклеофила и в первуюочередь наличием в структуре 6-АПК заряженной карбоксильной группы, что оказывает118очевидное воздействие на синтетические параметры. В таком случае корреляции должныбыть найдены для нуклеофилов схожей природы. Действительно, оказывается что S/H внутригруппы аминоспиртов меняется синхронно (рис. 48).14,0012,00R² = 0,7351ОИ S/H (ФА)10,008,006,004,002,000,000,005,0010,0015,0020,00ОИS/H (2-АБ)Рисунок 48. Корреляции между относительным изменением параметров S/H в реакцииацилирования 2-АБ и ФА для мутантных форм ecПА.
Исключены формы, содержащиемутацию bF24A, а также bF256R+bF71L.Третий возможный тип корреляций – соотношение α и β в реакции синтезаампициллина и амоксициллина, вытекает из логической взаимосвязи параметров. Нами былозамечено, что мутации, приводящие к увеличению параметра β негативно сказываются напараметре α, который также увеличивается, что, предположительно, может являтьсяследствием улучшения связывания бета-лактамной части обоих субстратов (KN для 6-АПК вслучае β и KP для ампициллина/амоксициллина в случае α). При построении зависимости(рис. 49) действительно была обнаружена относительно слабая корреляция для реакции 1а(R2=0,3), что может свидетельствовать о частичной зависимости параметров, возможно, из-забольшой схожести участков связывания нуклеофила и антибиотика. Для реакции 2экорреляция отсутствует, судя по всему, по причине того, что в выборку попали мутации,приводящие к изменению параметров по разным механизмам.
Так, например, мутация bF24Aнаправлена на подавление амидазной активности, а также на улучшение связыванияацильной части субстрата, а мутации bF256R и bF71L направлены на изменение связыванияамидной части субстрата.1198R² = 0,329276ОИ β543R² = 0,53221001234567ОИ αРисунок 49. Корреляции между относительными изменениями параметров β и α вреакции синтеза ампициллина (●) и амоксициллна (○)для мутантных форм ecПА. Исключенаформа bF256R+aR145G.На первый взгляд может показаться очевидной возможность установления корреляциймежду стереоселективностью внутри группы аминоспиртов, однако, данный параметротражает гораздо более тонкое свойство, чем S/H и тем более V0, и может оказаться гораздоболее чувствителен к мутации.
Данную ситуацию иллюстрирует пример с мутантом bF71A(рис. 50).300,00bF71A250,00ОИ Е (ФА)200,00150,00R² = 0,1645100,0050,000,000,002,004,00-50,00Рисунок50.Корреляции6,008,0010,0012,0014,00ОИ Е (2-АБ)междуотносительнымизменениемпараметрастереоселективности (E) в реакции ацилирования 2-АБ и ФА для мутантных форм ecПА.1203.8 Мутагенез для изменения каталитической активности3.8.1 Мутации bS1T, bS1C, bT68S, bS1T+bT68SОстаток bS1 - основной каталитический элемент ПА,определяющий принадлежность фермента к классу Ntnгидролаз, в которых нуклеофильным донором является Nконцевой серин, цистеин или треонин.
Так, остаток серинана N-конце характерен для всех известных ПА. Остатоктреонинавстречаетсяаспартилглюкозаминидаз.уОстатокпротеасомцистеинаиможнообнаружить у глутамин амидотрансфераз [126]. Известно,что для активных центров ферментов весьма характерноизоморфноезамещениекаталитическихгруппнародственные по структуре. Так, серин иногда может бытьРисунок 51. Остатки bS1 и bT68 замещен на треонин без существенного изменения вв активном центре ecПА.механизме катализа [127].
В литературе есть примеры, гдезамена нуклеофильного серина на треонин приводила кповышению активности фермента [128].Авторы работы [129] проводили замену N-концевого bS1 в ecПА на T, R, G и С. Ни водном из случаев фермент не удалось получить в активной форме. В случае замены S на T, R,G белок накапливался исключительно в виде предшественника, и только в случае замены Sна C получался зрелый неактивный фермент.
Неспособность мутантов к автопротеолизу вслучае замены S на T может являться следствием несоответствия размеров остатков иснижением доступности активного центра.С целью решения этой проблемы нами было предложено компенсировать возможноестерическое затруднение аналогичной «обратной» заменой соседнего остатка bT68 на S вмутанте bS1T+bT68S. По данным биоинформатического анализа суперсемейства Ntnгидролаз позиции b1 и b68 являются коррелирующими и меняются синхронно при переходеот одной подгруппы к другой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
