Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 19
Текст из файла (страница 19)
В связи с этим нами была детально изучена кинетика данной реакциив отношении рассматриваемых мутантов (табл. 40, рис. 54) и получены интегральные кривые(рис. 55).128Таблица 40. Кинетические параметры в реакции 2э для ecПА ДТ и мутантов,содержащих замену bF24A.Ферментαβ, M-1γPmax %**ДТ15,4*159±630,2±0,127%(1)bF24A0,4*367±330,07±0,0193%(2)0,3±0,1 285±450,16±0,0367%(3)bF24A+bF71L+bF256R 7,9±1,4 356±71 0,016±0,0178%(2)bF24A+bF71L% - Максимальный выход реакции по амидному компоненту. (*)-данные, полученныев [98] по отношению констант специфичности в реакции гидролиза ампициллина и п-ОН-DФГ метилового эфира.
**- максимальный выход для начальных условий S0=68 мМ(1), 56мМ(2), 66 мM(3) и N0=46 мМ(1),36 мМ(2), 46 мМ(3).Рисунок 54. Нуклеофильная реакционная способность 6-АПК в реакции 2э для ecПАДТ и мутантов на основе bF24A.Как видно из табл. 40 и рис. 54, наибольшее улучшение кинетических параметров β иγ характерно для тройного мутанта bF24A+bF71L+bF256R. По сравнению с ecПА ДТпараметр β увеличивается более чем в 2 раза, а параметр γ, отвечающий за эффективностьацильного переноса в высококонцентрированных системах уменьшается в 13 раз, чтоособенно важно для препаративного синтеза.
Наряду с этим, у всех мутантов, содержащих129замену bF24A, в 2 раза улучшается параметр относительной специфичности α. Однако, посравнению с одиночным мутантом bF24A, улучшение параметра α для тройного мутанта в 20раз менее значительно. Дополнительная мутация bF71L в целом негативно сказывается наэффективных параметрах ацильного переноса по сравнению с одиночным мутантом bF24A.Для частичного прояснения природы эффекта увеличения параметра β в реакции 2эбыл проведен анализ влияния отдельных скоростей на соотношение S/H. Как видно изтаблицы 41, мутация bF24A приводит к существенному увеличению скоростей синтеза игидролиза. Можно предположить, что удаление стерического затруднения в областисвязыванияСα-аминогруппыацильногодонораприводиткболееэффективномуобразованию ацилфермента и, как следствие, увеличению скорости лимитирующей стадии.Также следует отметить, что скорость синтеза увеличивается в большей степени, что иприводит к увеличению S/H.Таблица 41.
Влияние отдельных скоростей синтеза и гидролиза на соотношение S/Hдля иллюстрации влияния замены bF24A.ФерментОИS ОИH ОИS/HУсловия *ДТ111bF24A1243Реакция 2э: 30мМ 6-АПКbF24A+bF71L952Реакция 2э: 30мМ 6-АПКbF24A+bF71L+bF256R414Реакция 2э: 30мМ 6-АПК* Эксперименты с мутантными формами проводили в условиях идентичных поотношению к ДТ.Для апробации эффектов в препаративных условиях нами были полученыинтегральныекривыевусловияхприближенныхкмаксимальнойрастворимостикомпонентов реакции. На рисунке 55 видно, что на начальном участке кривых накопленияпродукта синтеза и гидролиза тройной мутант несколько превосходит одиночный bF24A посоотношению S/H. Однако, через некоторый промежуток времени (на рисунке 30-ая минута)начинает сказываться ухудшающий эффект α (7,9 по сравнению с 0,4).
Продукт начинает130гидролизоваться быстрее, чем в случае одиночного мутанта, что в конечном итоге приводит впотере максимального выхода (78% по сравнению с 93%).концентрация,М0,040,0350,030,0250,020,0150,010,0050020406080100120время, минРисунок 55. Накопление продуктов синтеза (сплошная линия) и гидролиза (пунктир) вреакции2эдляесПАДТ(серый)имутантовbF24A+bF71L(зеленый)иbF24A+bF71L+bF256R (голубой), bF24A (синий). Условия реакции: pH 6,3, T=30°С, 36 мМ 6АПК, 56 мМ п-ОН-D-ФГ метилового эфира.Несмотря на это обстоятельство, тройной мутант может быть более эффективенодиночного в таких системах, где наиболее сильно проявляется влияние параметра γ,например, в гетерогенных или пересыщенных растворах [42; 43], а также в системах, гдевклад параметра α можно нивелировать, выводя продукт из сферы реакции, например, припомощи солей цинка [130] или бета-нафтола [131].Для определения стереоспецифичности мутантов, содержащих замену bF24A,проводили стереоселективное ацилирования 2-АБ и ФА метиловым эфиром D-ФГ (табл.
42 и43).131Таблица 42. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов, содержащих замену bF24A, в реакцииацилирования 2-АБ эфиром D-ФГ.2-АБ + D-ФГ эфирФерментV0/E0 (с-1)V0/E0, с-1 S/HEsэ.и.50%ДТ0,70,02 3,7±0,6bF24A0,80,0220±190%bF24A+bF71L13,80,26,1±0,472%bF24A+bF71L+bF256R3,40,13,2±0,352%–57%удельная начальная скорость накопления продукта синтеза. Начальныеусловия pH 8,0, 30°C, S0=N0=50мМ.Таблица 43.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов, содержащих замену bF24A, в реакцииацилирования ФА эфиром D-ФГ.ФА + D-ФГ эфирФерментV0/E0, с-1 S/HEsэ.и.50%ДТ2,20,201,2±0,19%bF24A5,90,154,6±0,464%bF24A+bF71L34,20,47 6,0±0,1(R)71%bF24A+bF71L+bF256R2,00,08 1,8±0,1(R)29%V0/E0 (с-1)–удельная начальная скорость накопления продукта синтеза. Начальныеусловия pH 8,0, 30°C, S0=N0=50 мМ.Из представленных данных следует, что мутация bF24A приводит к 5- и 4-кратномуулучшению стереоселективности в реакциях ацилирования 2-АБ и ФА, соответственно, при132сохранении каталитической активности.
Дополнительные мутации bF71L и bF256Rотрицательно сказываются на стереоселективности. Добавление мутации bF71L приводит кзначительному увеличению каталитической активности. Параметр S/H в случае 2-АБ длядвойного мутанта также существенно увеличивается.Таким образом, мутация bF24A, действительно, может быть также рекомендована дляувеличения параметров эффективности ацильного переноса в случае использования эфиров вкачестве ацильного донора. Введение дополнительной мутации bF256R положительносказывается на параметре γ.
Также впервые показано положительное влияние мутации bF24Aна стереоселективность в реакциях ацилирования аминоспиртов эфиром D-ФГ.1333.9.2 Мутация aS149RОстатоккаталитическойaS149находитсяальфа-спирали,воснованииоднако,располагаясь на довольно большом расстоянии отактивного центра, не принимает непосредственногоучастия в катализе. Боковой радикал остатканаправлен в раствор. Аминокислотный составпозиции a149 в семействе ПА весьма разнообразен,Рисунок56.Ацилфермент- не встречаются, пожалуй, только заряженныенуклеофильный комплекс ecПА ДТ радикалы. Интересно при этом отметить, что среди(белый)СтруктурыО.В.иaS149Rполучены(голубой). АГЛА глицин в позиции a149 исключительноСтрогановым консервативен.Нами предполагается, что замена остатка на аргинин и, следовательно, введениедополнительного положительного заряда приведет к улучшению связывания карбоксильнойгруппы 6-АПК.
Как видно из рис. 56, в структуре ацилфермент-нуклеофильного комплексамутанта aS149R, полученной при помощи методов молекулярной динамики, гуанидиноваягруппа аргинина и карбоксильная 6-АПК действительно сближены, а значит естьвозможность для формирования дополнительного взаимодействия.Согласно полученным данным (табл. 44), мутация aS149R не приводит ксущественным изменениям в кинетических параметрах реакции гидролиза NIPAB. Вотношении термостабильности наблюдается 2-кратное увеличение константы инактивациипри 50°C, что предположительно можно приписать, с одной стороны, отталкиванию двухсоседних аргининов aR149 и aR145, а с другой, изменению диполя всего спиральногорегиона.134Таблица 44.
Кинетические параметры гидролиза NIPAB и термостабильность дляecПА ДТ и aS149R.NIPABФерментДТkcat, c-1pH 7,5; 50°C28,0±0,6 23,1±0,8aS149R31±1kin, мин-1KM, µM kcat/KM25,0±0,71,26,0±1,0·10-31,314,0±1,0·10-3В реакции синтеза ампициллина (1а) введение мутации aS149R приводит к 3-кратномуувеличению параметра β при практически неизменном параметре α. Параметр γ остаетсятаким же, как у ecПА ДТ, а максимальный выход при этом увеличивается на 4% (табл. 45).Таким образом, судя по всему, имеет место улучшение связывания карбоксильной группы 6АПК, причем карбоксильная группа продукта, предположительно, связывается в другомсайте.Таблица 45.
Кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и мутанта aS149R.Ферментαβ, M-1γPmax*ДТ13±257±30,05±0,0126%17±5 158±30 0,04±0,0330%aS149R*- Максимальный выход при начальных условиях S0=N0=50 мМ.В таблице 46 представлены данные по стереоселективности в реакциях с рацематамиалифатического 2-АБ и ароматического ФА (ФФА). Видно, что для мутанта aS149Rнаибольшее изменение наблюдается в реакции ацилирования 2-АБ амидом S-МК, гдезафиксировано 2-кратное улучшение стереоселективности по отношению к S-энантиомеру.135Таблица 46.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутанта aS149R в реакциях c 2-АБ, ФА, а также в реакциигидролиза ФФА.2-АБ + R-MК амидФермент V0/E0, с-1 S/H2-АБ + S-MК амидэ.и.50% V0/E0, с-1 S/HESэ.и.50%ESДТ0,40,02 12±185%0,30,05 2,3±0,140%aS149R0,20,038±177%0,10,03 5,1±0,567%ФА + R-MК амидФермент V0/E0, с-1 S/HГидролиз ФФАESэ.и.50% V0/E0, с-1ESэ.и.50%ДТ1,00,12,8±0,147%0,83,5±0,555%aS149R0,30,12,6±0,444%0,32,9±0,348%Таким образом, мутация aS149R может рассматриваться как потенциальная мишеньдля улучшения выхода в реакции 1а, а также для дополнительного улучшениястереоселективности в реакциях с 2-АБ.1363.9.3 Мутация bN388QОстаток bN388, наряду с остатком bR263,участвуетвпродуктивномсвязываниикарбоксильной группы бета-лактамного кольца ПенG.
Однако, продуктивные комплексы нуклеофила 6АПК и Пен-G отличаются тем, что в первом случаекарбоксильная группа более лабильна и направлена враствор.Чтобызафиксироватькарбоксильнуюгруппу 6-АПК, с целью улучшения связывания былопредложеноРисунокАцилфермент-57.удлинить остатокbN388 на однометиленовое звено в мутанте bN388Q (рис. 57).нуклеофильный комплекс ecПА ДТ(белый)иbN388QПри(голубой)получениимутантанамибылаСтруктуры получены Строгановым зафиксирована сильная потеря термостабильности(табл. 47), так что есть видимые основания приписатьО.В.данному остатку важнуюструктурообразующуюфункцию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
