Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 23
Текст из файла (страница 23)
68B, [134]).Рисунок 68. А: Сеть водородных взаимодействий ecПА ДТ в регионе, содержащемостатки bE482-bN484, при pH 7,5 и В: разрушение взимодействий при pH 10,0 [134].Поданнымбиоинформатическогоанализаостаткиb484иb482являютсявысокогруппспецифичными. D в позиции b484 присутствует в 50% ПА п/гр 1, содержащей157ecПА, другие же 50% представлены N. В п/гр 2 N присутствует уже в 80% ПА, в том числе вafПА, характеризующейся наиболее высокой щелочной стабильностью. В п/гр 4, содержащейbmПА, также характеризующуюся повышенной щелочной стабильностью, наблюдаетсяисключительно H. При этом в большинстве описанных случаев (80%) в позиции b482присутствует «комплементарный» E. Исключение составляет п/гр 3, для которой, как впозиции b484, так и в b482 наблюдаются гидрофобные ароматические и алифатическиеостатки, соответственно.
Таким образом, сеть водородных взаимодействий, характерных,предположительно, для п/гр 1, 2 и 4, заменяется, по всей видимости, в случае п/гр 3гидрофобным кластером.В данной работе [134] нами были получены активные мутанты bD484N и bD484H, поаналогии с afПА и bmПА, cоответственно. В реакции гидролиза NIPAB мутации по данномуостатку приводят к незначительному изменению каталитической константы и к почти 2кратному улучшению KM. (табл.
65). При изучении щелочной стабильности нами былозафиксировано 9-кратное уменьшение константы инактивации при pH 10 в случае мутацииbD484N. При этом, как и следовало, не наблюдали эффекта стабилизации при 50°С в областинейтральных pH. Также было показано, что данный эффект не связан с изменениямикаталитических свойств при увеличении pH.
Весьма интересным оказалось, что наряду сщелочной стабильностью, улучшается операционная стабильность при использованиивысоких концентраций реагентов (данные не представлены). Что касается мутации bD484H,то ее введение приводит к ухудшению щелочной и термостабильности (на порядок). Этоможет быть вызвано несоответствием размеров заменяемого остатка и доступной для тогополости.158Таблица 65. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутантов bD484N/H.NIPABpH 7,5; 50°C*,** pH 10; 25°C**Ферментkcat, c-1KM, µMkcat/KMkin, мин-1kin, мин-1ДТ28,0±0,623,1±0,81,29±1·10-32,6±0,8·10-3bD484N19,5±0,914,8±0,51,38±1·10-32,9±0,1·10-4bD484H22,6±(0,9) 14,9±(0,5)1,58±1·10-27,5±0,9·10-3*0,1 M KCl, ** по результатом трех независимых экспериментов.При сравнении стабильности мутанта bD484N c природными ферментами afПА иbmПА, обладающими сдвинутыми в область щелочных pH профилями каталитическойактивности нами были получены диаграммы, приведенные на рисунке 69.0,004pH10.00,6kin мин-1kin мин-10,0030,7pH11.00,50,40,0020,30,20,001А0,0000,1Б0,0ecПА ДТ ecПА bD484NafПАbmПАecПА ДТ ecПА bD484NafПАbmПАРисунок 69.
Щелочная стабильность пенициллинацилаз. Условия: pH 10,0, 10мМCAPS, 25oС (А), pH 11,0, 100мМ CAPS, 25oС (Б). Приведены данные для серии из 3-хнезависимых экспериментов.Несмотря на многократное улучшение стабильности по сравнению с ecПА ДТ при pH10, величина константы инактивации для ecПА bD484N, сравнимая с константой для bmПА,все еще на порядок превышает константу для afПА. Исчезновение эффекта стабилизации при159pH 11 можно, предположительно, отнести к более существенной глобальной потерестабильности, на фоне которой эффект от одиночной мутации едва может быть заметен.Для объяснения эффекта стабилизации при pH 10, нами были рассчитанымолекулярно-динамические траектории для региона, содержащего остатки b484-b482, дляecПА ДТ и мутантной формы bD484N на отрезке 50 нс.
Как видно из рисунка 70, при pH 10для ecПА ДТ наблюдается значительное изменение подвижности региона (красная кривая),что соответствует картине, представленной на рис.68B, которая реализуется вследствиеотталкивания одноименных зарядов. В случае мутанта bD484N отталкивания не происходит,что находит отражение в отсутствии заметных изменений в подвижности региона (зеленаякривая). Более детальное объяснение механизма pH-индуцированной дестабилизации иописание молекулярно-динамических расчетов для других регионов ecПА ДТ и bD484Nпредставлено в работе [134].Рисунок 70. Молекулярно-динамические траектории для региона, содержащегоостатки bE482-bN484 [134].Высокая стабильность фермента в щелочных условиях может быть использована припроведении реакций ацильного переноса.
При высоких pH активность реакционоспособнойаминогруппы, а также растворимости многих субстратов существенно увеличиваются. Дляиллюстрации каталитических способностей мутанта bD484N в таких условиях нами былапроведена реакция синтеза цефалексина при pH 9,0 (рис. 71). Как видно из рисунка,активность bD484N сохраняется на существенно большем временном интервале по160сравнению с ДТ, что приводит к 5-кратному увеличению выхода целевого антибиотика дляконцентрация, Мданных условий (см. патент [135]).0,180,160,140,120,10,080,060,040,02010,90,80,70,60,50,40,30,20,10050100150200250время, минРисунок 71. Синтез цефалексина для ecПА ДТ (красный) и bD484N (зеленый).
Кривыенакопления продукта синтеза (сплошная линия) и активность фермента (пунктир). Правая осьординат - доли остаточной активности. Условия реакции: 0,5 М 7-АДЦК, 0,5 М D-ФГ амида,pH 9,0.Аналогичную картину можно наблюдать при синтезе дипептидов. Так, при переносеацильной группы D-ФГ амида на глицин при pH 9,5 можно также получить 5-кратноеконцентрация, Мувеличение выхода реакции: с 19% для ecПА ДТ до 87% для bD484N (рис.72).0,180,160,140,120,10,080,060,040,02010,90,80,70,60,50,40,30,20,10050100150200250время, минРисунок 72. Синтез D-ФГ-глицина для ecПА ДТ (красный) и bD484N (зеленый).Кривые накопления продукта синтеза (сплошная линия) и активность фермента (пунктир).161Правая ось ординат - доли остаточной активности.
Условия реакции: 0,18 М глицина, 0,18 МD-ФГ амида, pH 9,5.Также высокая щелочная стабильность фермента может быть использована впроцедурах щелочного выделения и очистки, когда на первом этапе проводят щелочнуюденатурацию, а затем при снижении pH избавляются от посторонних компонентов. Однако,отработка методики требует проведения дополнительных экспериментов.Подводя итоги, мутацию bD484N, таким образом, можно рекомендовать в качествефактора улучшения щелочной и операционной стабильности. Представленное вышеобъяснение механизма щелочной дестабилизации также имеет фундаментальное ипрактическое значение.1623.11.3 Мутация bR297AВработе[136]проводили«аланиновоесканирование» поверхностных остатков, образующихсолевые мостики.
Было показано, что их вклад встабильность составляет приблизительно 1 ккал/моль,что в 3-4 раза меньше, чем эффект от внутреннихсолевых мостиков. Внутренние солевые мостики могутиграть существенную роль в поддержании структуры[86]. Также они могут выступать как потенциальныемишени для улучшения термостабильности при заменеРисунок73.ОстатокbR297вструктуре ecПА и его полярныеконтакты.солевых триад на гидрофобные, т.к. известно, чтогидрофобные взаимодействия вносят больший вклад встабильнось, образуются на порядок быстрее и«предъявляют» меньше стерических требований [137].При проведении биоинформатического анализа было установлено, что R в позицииb297 (рис.73), также как и E в позиции b266, консервативны для п/гр 1-3.Единичныеисключения встречаются среди морских и почвенных представителей ПА.
Для п/гр 4характерны незаряженные аминокислоты, и, скорее всего, данный регион выполняет инуюфункцию. Также интересно отметить, что среди ГА в позиции b297 встречаетсяисключительно кислый (D или E) остаток, в то время как в «комплементарной» позицииb266, наоборот, по большей части присутствует положительный R.Для установления роли солевой триады bR297-bE266-bN262 (рис.73) в ecПА намибылаполученамутацияbR297A,котораяпривелакзначительномупадениютермостабильности при практически неизменных кинетических параметрах гидролиза NIPAB(табл. 66).163Таблица 66.
Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутанта bR297A.NIPABФерментДТbR297Akcat, c-1pH 7; 50°C pH 10; 25°C28,0±0,6 23,1±0,829±1kin, мин-1kin, мин-11,27,2±0,1·10-42,2±0,1·10-31,35,4±0,4·10-22,1±0,1·10-2KM, µM kcat/KM22,3±0,8Константа инактивации при 50°C увеличилась более чем в 60 раз, что можетсвидетельствовать о существенной роли триады в поддержании третичной структуры белка ислужить указанием для направленного дизайна стабильности за счет гидрофобизациирегиона.1643.11.4 Мутация bL220EНесмотрянанизкийэнергетическийвыигрыш от электростатических взаимодействийна поверхности белковой глобулы [136], нами былапредложена мутация поверхностного гидрофобноголейцина на заряженный глутамат (рис. 74), с цельюво-первых,обеспечитьэлетростатическоедополнительноевзаимодействиеслизином,лежащим в основании соседней альфа-спиралиРисунок 74. Мутант bL220E (синий) в (похожая ситуация описана в работе [9], гдеструктуреecПА(белый).Структура получили мутант bW431R (см.
п.1.2.2.2)), а во-получена при помощи программы Mutate.вторых, удалить неполярный остаток из полярногоокружения. Следует отметить, что позиция b220является группспецифичной и аминокислотный состав в семействе ПА и АГЛА представленисключительно неполярными остатками.В данной работе нами была получена мутация bL220E. Стабильность ферментаизучали при высокой температуре 50°С и нейтральном pH 7,0.
При сравнении с препаратомecПА ДТ не было отмечено сколько-нибудь существенных отличий, что свидетельствует впользу предположения о низком вкладе поверхностных остатков в стабильность белка.1653.11.5 Мутация aA173C+bA410CВработепредложена[138]оригинальнаяметодика дизайна дисульфидных связей для улучшениястабильности.предсказанийОсновываясьдвухнанезависимыхобобщениипрограммдлягенерации дисудьфидных мостиков (DbD [139] иMODIP [140]) в структуре белка, авторы обращаютвнимание на те позиции, для которых суммарныйтемпературныйРисунок75.дисульфиднойОбразованиесвязи в моделиecПА aA173C+bA410C.значения.Такфакториз47достигаетвозможныхнаибольшегомутантов,предсказанных двумя программами, авторы выбирают5.
И лишь для одного из них наблюдается улучшениестабильности (суммарный B-фактор = 25).Для есПА программа DbD предсказывает 15 возможных межсубъединичныхдисульфидных связей. Руководствуясь принципом наиболее «мягких» структурных замен(замена A на C) и высоким суммарным температурным фактором (B-фактор=27), нами былполучен мутант aA173C+bA410C (рис. 75).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
