Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Образование дисульфидной связи подтверждалинативным электрофорезом. При этом фиксировали наличие одной единственной полосы науровне 86 КДа (данные не представлены).Стабильность мутанта изучали в условиях сохранения дисульфидной связи при 25°СpH 7,5 и pH 10, а также при 50°С. Однако, не было замечено сколько-нибудь существенногоизменения стабильности при выбранных условиях. Данный факт, можно полагать,согласуется со статистикой представленной в работе [138] и еще раз подчеркивает то мнение,что дизайн дисульфидных связей для улучшения стабильности представляет собой довольнотонкий момент, несмотря на довольно существенные указания.1663.11.6 Мутации bR533C+bW500C, bM485RЕще одним подходом к улучшению стабильностиза счет дизайна дисульфидных мостиков является их«копирование»изродственныхтермостабильныхферментов.
Стоит отметить, что в структуре природнойecПА нет ни одного цистеина. В то же время в структуреодногоизнаиболеетермостабильныхферментовсемейства afПА есть два цистеина, которые, судя поРисунок 76. Сравнение участка всему, образуют дисульфидную связь (рис. 76). Этиструктур ecПА (белый) и afПА остатки соответствуют позициям bR533 и bW500 в(желтый).ecПА. По данным биоинформатического анализа этиостатки являются высокогруппспецифичными.
В п/гр 1,содержащей ecПА, аминокислотный состав распределен таким образом, что встречаютсялибо пары R,K/W (50%), либо N,S/V (40%). В п/гр 2 (afПА) и 3 (abПА) встречаютсяисключительно пары С/С. Для п/гр 4 (bm ПА) характерны ароматические остатки F/F, причемдля bmПА в данном регионе можно обнаружить целый ароматический кластер bF19-bY485bF530-bF533 (в соответствии с нумерацией ecПА).Для создания дисульфидного мостика в ecПА аналогичного в afПА нами былапредложена мутация bR533C+bW500C, а также замена bM485R, компенсирующая удалениезаряда,исчезающегопризаменеbR533C(позицияb485такжеявляетсявысокогруппспецифичной). Было показано (табл.
67), что одиночные мутанты bR533C,bM485R, а также bR533C+bM485R теряют свою стабильность (активность) уже на стадиикультивирования. Мутация bW500C сама по себе приводит к заметной потере стабильности.Тройной мутант также гораздо менее стабилен, чем исходно ДТ. И только при двойноймутации bR533C+bW500C удается получить белок, стабильность которого сравнима сисходной есПА ДТ.167Таблица 67. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутантов по остаткам b533, b530, b485.NIPABФерментkcat, c-1KM, µM kcat/KMpH 7; 50°CpH 10; 25°Ckin, мин-1kin, мин-128,0±0,6 23,1±0,81,27,2±0,1·10-42,2±0,1·10-320,6±0,518±11,114,5±1,0·10-45,7±0,1·10-3bR533+bW500C+bM485R 26,3±0,521±11,33,0±0,2·10-2н.д.1,41,9±0,1·10-2н.д.ДТbR533+bW500CbW500C29,6±0,4 20,7±0,9bR533Cн.а.н.а.н.а.н.а.н.а.bM485Rн.а.н.а.н.а.н.а.н.а.bR533C+bM485Rн.а.н.а.н.а.н.а.н.а.Данные факты могут косвенно свидетельствовать об образовании дисульфиднойсвязи или же о более благоприятной геометрии, нежели в одиночных мутантах, что, однако,не приводит к эффекту стабилизации ecПА.168ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1.
C помощью направленного мутагенеза получены двадцать семь новых активныхмутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli. На основании систематическогоизучения их каталитических свойств и стабильности показано, что направленный мутагенезпозволяет существенно и целенаправленно изменять свойства фермента.2. Связывание и ориентация 6-аминопенициллановой кислоты путем введения мутацииbF256R позволяет в 4 раза, а в комбинации с aR145G более чем в 20 раз увеличитьэффективность ацилирования в реакции синтеза бета-лактамных антибиотиков; обеспечениеболее эффективного связывания S-формы аминоспирта за счет введения мутации bF71Aприводит к 250-кратному увеличению стереоселективности в реакции ацилированияароматических аминоспиртов.3.
Установлено, что солевая триада bR297-bE266-bN262 и карбоксил-карбоксилатная bE482bD484 пара играют существенную роль в поддержании третичной структуры белка.Отталкивание однозарядной пары остатков bE482-bD484 определяет низкую стабильностьпенициллинацилазы из Escherichia coli в щелочной среде. Обнаружена мутация bD484N,которая позволяет сохранить взаимодействие между остатками в щелочной среде и приводитк 9-кратному увеличению щелочной, а также операционной стабильности.4.
Показана возможность замены консервативного для пенициллинацилаз N-концевогонуклеофильного серина bS1 на треонин с сохранением каталитической активности путемвведения компенсирующей мутации.5. Обнаружены прямые корреляции между активностью мутантных форм в реакцияхгидролиза цветного субстрата и синтеза N-ацильных производных аминоспиртов, а такжемежду эффективностями ацилирования ароматических и алифатических аминоспиртов.169СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1. Chandel A., Rao L., Narasu M., Singh O., Martino S. Di. The realm of penicillin G acylase in βlactam antibiotics // Enzyme Microb. Technol. 2007. Т.
42. С. 199–207.2. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic modification of beta-lactam antibiotics:problems and perspectives // Enzym. Eng. Futur. Dir. Plenum Press. 1980. С. 257–293.3. Arroyo M., la Mata I. de, Acebal C., Castillón M.P. Biotechnological applications of penicillinacylases: state-of-the-art. // Appl. Microbiol. Biotechnol.
2003. Т. 60. № 5. С. 507–14.4. Швядас В.. Ферментативный синтез и модификация бета-лактамных антибиотиков ипептидов. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, ВИНИТИ. 1988. Т. 7. С. 148.5. Jager S., Shapovalova I. V, Jekel P. a, Alkema W.B.L., Svedas V.K., Janssen D.B. Saturationmutagenesis reveals the importance of residues alphaR145 and alphaF146 of penicillin acylase inthe synthesis of beta-lactam antibiotics. // J. Biotechnol. 2008. Т. 133. № 1.
С. 18–26.6. Deaguero A.L., Blum J.K., Bommarius A.S. Improving the diastereoselectivity of penicillin Gacylase for ampicillin synthesis from racemic substrates. // Protein Eng. Des. Sel. 2012. Т. 25. № 3.С. 135–44.7. Polizzi K.M., Chaparro-Riggers J.F., Vazquez-Figueroa E., Bommarius A.S. Structure-guidedconsensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase.
// Biotechnol. J. 2006. Т. 1.№ 5. С. 531–6.8. Morillas M., Vey C.E.M.C., Brannigan J.A., Ladurner A.G., Forney L.J., Virden R. Mutations ofpenicillin acylase residue B71 extend substrate specificity by decreasing steric constraints forsubstrate binding // Biochem. J. 2003. Т. 150. С. 143–150.9. DelRio G., Soberon X. An Engineered Penicillin Acylase with Altered Surface Charge Is MoreStable in Alkaline pH // Ann. New York Acad. Sci.
1996. № 799. С. 61–64.10. Oh В., Kim K., Park J., Yoon J., Han D., Kim Y. Modifying the substrate specificity ofpenicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating residues “active site” // Biochem.Biophys. Res. Commun. 2004. Т. 319. С. 486–492.11. Davids T., Schmidt M., Böttcher D., Bornscheuer U.T. Strategies for the discovery andengineering of enzymes for biocatalysis. // Curr. Opin. Chem. Biol.
2013. Т. 17. № 2. С. 215–20.12. Kaufmann W., Bauer K. The production of penicillin amidase by Escherichia coli ATCC9637. //J Gen Microbiol. 1964. Т. 35. С. 4–5.13. Vojtisek V., Slezak J. Penicillinamidohydrolase in Escherichia coli. III. Catabolite repression,diauxie, effect of cAMP and nature of the enzyme induction. // Folia Microbiol. 1975. Т. 20. С.298–306.17014. Merino E., Balbás P., Recillas F., Becerril B., Valle F., Bolivar F.
Carbon regulation and the rolein nature of the Escherichia coli penicillin acylase (pac) gene. // Mol. Microbiol. 1992. Т. 6. № 15.С. 2175–82.15. Valle F., Baibas P., Merino E., Bolivar F. The role of penicillin amidases in nature and inindustry. // Trends Bio- chem Sci. 1991. Т. 16. С. 36–40.16. Duggleby H., Tolley S., Hill C., Dodson E., Dodson G., Moody P. Penicillin acylase has asingle-amino-acid catalytic centre. // Nature. 1995. Т. 373. С.
264–8.17. Roa A., Castillón M., Goble M., Virden R., García J. New insights on the specificity ofpenicillin acylase // Biochem Biophys Res Commun. 1995. Т. 206. С. 629–36.18. Sakaguchi K., Murao S. A preliminary report on a new enzyme, “penicillin-amidase”" // J.Agric. Chem. Soc. Jpn. 1950. Т. 23. С. 411.19. Warburton D., Balasingham K., Dunnill P., Lilly M. The preparation and kinetics ofimmobilised penicillin amidase from Escherichia coli. // Biochim Biophys Acta.
1972. Т. 284. № 1.С. 278–284.20. Balasingham K., Warburton D., Dunnill P., Lilly M. The isolation and kinetics of penicillinamidase from Escherichia coli // Biochim Biophys Acta. 1972. Т. 276. № 1. С. 250–256.21. Rolinson G.N., Batchelor F.R., Butterworth D., Cameron-Wood J., Cole M., Eustace G.C.,Marian V., Richards M., Chain E.B. Formation of 6-aminopenicillanic acid from penicillin byenzymic hydrolysis // Nature.
1960. Т. 187. С. 236–7.22. Kaufmann W., Bauer K. Enzymatic cleavage and resynthesis of penicillins //Naturwissenschaften. 1960. Т. 47. С. 474–475.23. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic synthesis of beta-lactam antibiotics: athermodynamic backgroung. // Enzyme.Microb.Technol. 1980. Т. 2. С. 138–144.24. Deshpande B.S., Ambedkar S.S., Sudhakaran V.K., Shewale J.G. Molecular biology of betalactam acylases // J. Microbiol. Biotechnol.
1994. Т. 10. С. 129–138.25. Svedas V., Savchenko M., Beltser A., Guranda D. Enantioselective Penicillin Acylase-catalyzedReactions // Ann. New York Acad. Sci. 1996. Т. 799. С. 659–669.26. Cole M. Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli // Nature. 1964. Т.203.27. Margolin A., Svedas V., Berezin I. Substrate specificity of penicillin amidase from E. coli. //Biochim Biophys Acta. 1980. Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
