Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Подобная комбинация встречается в семействе протеасом.Остаток bT68 находится в непосредственной близости с остатком bS1 (рис. 51) на расстоянии3.8Å (между Сβ атомами). Двойная замена не приводит к общему увеличению числа атомов в121столь значимом для катализа регионе и, действительно, удается получить зрелый и активныйбелок.При изучении кинетики реакции гидролиза NIPAB было обнаружено 1,5-кратноеулучшение каталитической активности для мутанта bS1T+bT68S, в равной степени за счетулучшения kcat и KM (табл. 34). При этом отдельно мутант bS1T, также как и bS1C, не обладалактивностью, что согласуется с результатами [129]. Одиночный мутант bT68S в 8 раз теряет вkcat и более чем на один порядок в термостабильности, что также свидетельствует о взаимномдополнении мутаций bT68S и bS1T. Также важно отметить отсутствие дестабилизации дляbS1T+bT68S, по сравнению с ecПА ДТ. Тот факт, что для мутанта bT68S наблюдается болеечем 2-кратное уменьшение KM не обязательно означает улучшение связывания, а может бытьвызвано сильным падением kcat (KM = (koff+kcat)/kon).Таблица 34.
Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТи мутантов на основе bS1X и bT68S.NIPABpH 7; 50°CФерментkcat, c-1KM, µMkcat/KMkin, мин-1ДТ28,0±0,623,1±0,81,27,2±0,1·10-4bS1Tн.а.н.а.н.а.н.а.bT68S3,3±(0,2)10,4±(0,5)0,31,4±(0,3)·10-2*bS1T+bT68S 34,5±(1,7) 19,8±(1,0)1,79±1·10-4bS1Cн.а.н.а.н.а.н.а.bS1С+bT68Sн.а.н.а.н.а.н.а.* - приведены данные для pH 7,5.При изучении реакции 1а для мутанта bS1T+bT68S было обнаружено увеличениепараметра S/H в 1,4 раза, а также незначительное увеличение каталитической активности,при отсутствии заметных изменений в эффективных кинетических параметрах (табл.35).122Таблица 35.
Кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и bS1T+bT68S.ФерментV0/E0, с-1*ДТ1,5±0,1aT68S+bS1T1,7±0,1β, M-1γ1,3±0,1 13±254±60,14±0,031,8±0,2 15±161±30,12±0,01S/H*αV0/E0 (с-1) – удельная начальная скорость накопления продукта синтеза. * для условийS0=N0=50мM.В реакции ацилирования аминоспиртов амидом R-МК для двойного мутантаbS1T+bT68S наблюдали почти 2-кратное увеличение каталитической активности в реакцииацилирования 2-АБ и менее значительное в случае ацилирования ФА при сохраненииэффективности синтеза и стереоспецифичности. Для одиночного мутанта bT68S наблюдализначительное ухудшение каталитических параметров (табл.
36-37).Таблица 36. Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и мутантов bS1T+bT68S и bT68S в реакции ацилирования 2-АБамидом R-МК.2-АБ + R-MК амидФерментV0/E0, с-1 S/HEsэ.и.50%ДТ0,40,0212±184%bS1T+bT68S0,70,0210±182%bT68S0,010,05 3,0±0,249%V0/E0 (с-1) – удельная начальная скорость накопления продукта синтеза.123Таблица 37.
Стереоселективность, каталитическая активность и эффективностьацильного переноса есПА ДТ и bS1T+bT68S в реакции ацилирования ФА амидом R-МК.ФА + R-MК амидФерментV0/E0, с-1 S/HEsэ.и.50%ДТ10,12,8±0,147%bS1T+bT68S1,20,13,1±0,251%V0/E0 (с-1) – удельная начальная скорость накопления продукта синтеза.Таким образом, комбинация мутаций bS1T+bT68S приводит к зрелому ферменту иможет рассматриваться как дополнительный фактор улучшения каталитической активности иS/H при конструировании многоточечных мутантов.1243.8.2 Мутации bI177V, bW154FДля использования ПА в реакциях полученияполусинтетическихжелательнавысокаябета-лактамныхспецифичностьантибиотиковферментаксоответствующим производным ФУК.
В работах [98; 99]были получены мутации по остаткам bF24 и aF146,улучшающие связывание для Сα-производных ФУК. Длярасширения субстратной специфичности ecПА в даннойработеРисунок52.Остаткигидрофобного кармана ecПА.былопредложенорасширить(углубить)гидрофобный карман за счет мутаций bI177V и bW154F,сохраняющих природу остатка, но занимающих меньшийобъем (рис.52).По данным биоинформатического анализа (см. приложение 4) остатки bI177 и bW154являются консервативными во всем семействе ПА. В позиции b177 в п/гр 1-3 встречаетсяисключительно I, а в п/гр 4 (bmПА) - изомер L.
Для АГЛА характерен меньший по размеру V,в то время как в группе ГА - это ароматический F. В позиции b154, аналогично, в п/гр 1-3встречается исключительно W, а в п/гр 4 - Y. Такое же распределение (W и Y) сохраняетсядля АГЛА и ГА. Таким образом, указанные мутации можно обнаружить в природе в тех илииных ферментах, что гипотетически повышает вероятность получить мутантые препараты вактивной форме.Действительно, нами были получены активные препараты ecПА bI177V и bW154F.Как и следовало ожидать, при изучении кинетики гидролиза NIPAB, ацильная часть которогопредставлена ФУК, обнаружилось ухудшение связывания и катализа, что привело куменьшению константы специфичности практически на порядок (табл. 38).125Таблица 38.
Кинетические параметры гидролиза NIPAB для ecПА ДТ и ее мутантов.NIPABФерментkcat, c-1pH 7,5; 50°C*KM, µM kcat/KMkin, мин-128,0±0,6 23,1±0,81,23,7±0,2·10-39,2±0,351±20,182,2±(0,2)·10-3bW154F** 13,7±0,583±30,166,2±(0,3)·10-3ДТbI177V*** 0,1М KCl,** Использовали периплазматический экстракт.Для изучения эффекта мутации на связывание производных ФУК в гидрофобномкармане проводили ингибиторный анализ для таких субстратов как п-ОН-ФУК, ФОУК, пCH3-ФГ, п-OH-ФГ. Для обоих мутантов наблюдали либо сохранение, либо незначительноеухудшение ингибирования, что может свидетельствовать как об отсутствии эффекта, так и овозможном общем ухудшении связывания фенильной части, что само по себе можетмаскировать менее значительный эффект от связывания радикала (в п-положении или за счетудлинения в ФОУК).Таким образом, была подтверждена существенная роль остатков bI177 и bW154 вфенилацетильной специфичности ecПА.
Детальное изучение специфичности к производнымФУК для мутантных форм bI177V и bW154F требует постановки дополнительныхэкспериментов.1263.9 Мутагенез для изменения эффективности синтеза3.9.1 Мутации bF24A, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256RОстаток bF24 участвует в формировании боковойстенки гидрофобного кармана и, судя по всему, вовлечен всвязываниесфенильнымкольцомацильнойчастисубстрата посредством гидрофобных взаимодействий [99].Исключительно ароматический F встречается в п/гр 1 и 2(см. приложение 4), а также в АГЛА, однако для п/гр 4,содержащей bmПА, характерен уже алифатический V (L вГА), при этом потенциально освободившееся местозанимаетF,искусственнойРисунок 53.
ecПА ДТ (белый) и алифатическийсоответствующиймутацииAнеостаткаbP49bF24происходитвecПА.наПрималенькийзначительнойbF24A (зеленый) в комплексе с реорганизации каталитических остатков (рис. 53, pdb 1k7d иCαCH3-ФУК.1k5s). Удаление фенильного кольца приводит к появлениюдополнительного пространства в связывающем кармане длялучшего размещения Cα-заместителя в (R)-энантиомерах, что объясняет 10-кратноеулучшение связывания, наблюдаемое авторами в работе [99].В работе [6] такжеустановлено, что замены F в позиции bF24 на S, P и C приводят к существенному эффектуувеличения стереоселективности по отношению к (R)-ФГ.Ранее было показано, что мутация bF24A, наряду с улучшением параметра S/H дляреакций 1-4, приводит к значительному уменьшению параметра α, при использовании эфировв качестве доноров ацильной части ([98], реакции 1э-4э), что является следствием потериферментом амидазной активности при сохранении эстеразной, благодаря чему становитсявозможным разобщение процессов гидролиза сильной амидной (вновь образуемый продуктсинтеза) и слабой эфирной связи (исходный донор).
В настоящей работе было предложенообъединить данный эффект дополнительно с эффектом улучшения α, характерного длямутации bF71L (реакция 1а), а также с эффектом улучшения параметра β, характерного длямутации bF256R (реакция 1а). Таким образом, нами были получены активные мутантыbF24A, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256R, а также плазмида с мутацией bF24A+bF256R.127В последнем случае наработать активный белок не удалось, судя по всему, по причине егонизкой стабильности.В отношении реакции гидролиза NIPAB для мутанта bF24A наблюдали сильноеухудшение константы специфичности, вызванное как почти 10-кратным уменьшением kcat таки 20-кратным увеличением KM (табл.39). При этом стоит отметить, что наличие аминогруппыв Cα положении субстрата заметно улучшает связывание и, в соответствии с [99], наилучшимсубстратом для данного мутанта является NIPGB.
Мутация bF71L приводит к заметномуулучшениюобоихкинетическихпараметров,такчтоконстантаспецифичностиувеличивается почти в 50 раз, по сравнению с одиночным bF24A. «Ухудшающая» мутацияbF256R остается в данном случае фактически нейтральной. Следует также отметить, что вотношении термостабильности мутация bF24A не играет сколько-нибудь существенной роли.Таблица 39. Кинетические параметры гидролиза NIPAB для ecПА ДТ и мутантов,содержащих замену bF24A.NIPABФерментДТkcat, c-1pH 7,5; 50°C*KM, µM kcat/KM28,0±0,6 23,1±0,8kin, мин-11,23,6±0,5·10-3bF24A2,7±0,2486±190,0063,9±0,1·10-3bF24A+bF71L15±355±50,272,2±0,2·10-2bF24A+bF71L+bF256R12±245±30,264,7±0,2·10-2* 0,1M KCl.В работе [98] было показано, что наибольшего эффекта в улучшении параметра αможно достигнуть в реакции синтеза амоксициллина при использовании донора п-ОН-D-ФГметилового эфира (2э).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
