Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности (1105631), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Текст программы представлен в приложении 3.Докинг субстратов в активный центр фермента, а также оценку энергии связыванияпроводили в программе LeadFinder GUI 1.2.40.185 (BioMolTech, Inc). Структуры мутантовполучали в программе Mutate (версия 1.0.2 билд 24.08, ООО "Молекулярные технологии").Полноатомные структуры генерировали при помощи программы BuildModel 1.2.0 билд6.11 (BioMolTech, Inc). Визуализацию .pdb файлов осуществляли при помощи программPyMol 1.0r1 (DeLano Scientific LLC) и VMD 1.8.7 (TCBG University of Illinois).852.2.21 Методы статистической обработки результатовКоличественные значения целевых параметров (kcat, KM, kin, α, β, γ, E) былипредставлены после статистической обработки экспериментальных данных в программахMicrosoft Excel 2007(Microsoft) и Sigma Plot 10.0 (Systat Software, Inc).
За некоторымисключением, погрешности представленные в работе, представляют собой результатобработкимассиваданныхединичногоэксперимента.Значенияпогрешности,представленные в скобках, рассчитаны на основе усредненной погрешности в аналогичныхэкспериментах.863 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Постановка задачиПри анализе литературных и патентных источников по природным и мутантным ПАустановлено, что на текущий момент существует потребность в получении фермента сувеличенной эффективностью в реакции синтеза бета-лактамных антибиотиков, а такжеувеличенной стабильностью в области щелочных pH и высоких концентраций реагентов.Также отсутствуют препараты ПА с достаточной стереоселективностью в отношениипервичных аминов и аминоспиртов.
Для решения данных проблем перспективнымпредставляется использовать методы белковой инженерии. Ввиду того, что ecПА являетсяхорошо изученным объектом, наиболее целесообразно использовать подходы, основанные напервичном предсказании и последующем направленном мутагенезе.При выборе точек для направленного мутагенеза могут быть использованы различныевзаимодополняющие подходы, такие как визуальный анализ структуры, молекулярнаядинамика и докинг, биоинформатический анализ, анализ литературы и различныепрограммы, например, по дизайну дисульфидных связей.
С помощью таких подходов намибыли выбраны горячие точки мутагенеза – одиночные мутации, которые представлены втаблице 24. Данные точки (рисунок 28) были распределены по всей структуре: в областиактивного сайта, на участках связывания ацильной части и нуклеофила, а также напериферии.Таблица 24. Выбор горячих точек мутагенеза.МетодМутацияЛокализацияАнализ структурыbS1T+bT68Sактивный центрbI177Vучасток связывания ацильной частиbW154Fучасток связывания ацильной частиbF71Aучасток связывания нуклеофилаbL220Eпериферия87Анализ структуры/aS149Rучасток связывания нуклеофилаМолекулярная динамикаbN388Qучасток связывания нуклеофилаbF256Rучасток связывания нуклеофилаbA255Rучасток связывания нуклеофилаbD484NпериферияbD484HпериферияbQ292RпериферияbR533C+bW500CпериферияbR297AпериферияbF24Aучасток связывания ацильной частиbF71Lучасток связывания нуклеофилаaA173C+bA410CпериферияБиоинформатический анализЛитератураДругие программы(DbD, MODIP)88Рисунок 28 Локализация горячих точек мутагенеза.
Красный – активный центр,желтый – участок связывания ацильной части, зеленый – участок связывания нуклеофила,синий – периферия.Одиночные мутации в некоторых случаях объединяли при получении многоточечныхмутантов. При этом руководствовались, с одной стороны, принципом накопленияпозитивных эффектов от отдельных мутаций, а с другой, получением целевого эффекта откомбинации мутаций.
С этой целью нами рассматривались коррелирующие остатки,фиксирующие элементы, аналогии в родственных ферментах и дисульфидные мостики(таблица 25).89Таблица 25.Стратегии объединения мутацийОдиночные мутацииМноготочечные мутацииПринцип объединенияbS1T, bS1C, bT68SbS1T+bT68SПолучение целевого эффектаот комбинации мутаций:bS1C+bT68SКоррелирующие позицииbQ292R, bI329bQ292R+bI329EФиксирующие мутацииbW500C, bM485R, bR533CbR533C+bM485RКопирование из родственныхbR533C+bW500CферментовbR533C+bW500C+bM485RaA186C+bS243CДисульфидные мостикиbA306C+bV423CaA173C+bB410CbF256R, bF71L, bN388Q,aR145G+bF256RОбъединение позитивныхbF24A, aS149R, aR145GbF24A+bF256Rэффектов от одиночныхbF256R+bF71LмутацийbA255R+bF71LbN388Q+bF71LbF24A+bF71LbF256R+bS149RbF256R+bN388Q+bF71LbF24A+bF256R+bF71LbR297A, bD484N, bD484H,нетbL220E, bF71A, bI177V,bW154F903.2 Получение генов мутантных формДля введения мутаций в ген ecПА использовали сайт-направленный ПЦР мутагенез.Основная часть мутантов (25 клонов) была получена по схеме QuikChange™ ПЦР мутагенеза,другую часть (11 клонов) получали по классической схеме ПЦР мутагенеза с перекрыванием.Схему QuikChange ПЦР мутагенеза (схема 3) использовали при получении мутантов:bQ292R, bR297A, bD484N, bD484H, bI329E, bS1T, aT68S, aT68S+bS1T, bS1C, bS1C+bT68S,bQ292R+bI329E,bW500C,bR533C+bW500C+bM485R,bM485R,bL220E,bR533C,bF71A,bR533C+bM485R,bI177V,bW154F,bR533C+bW500C,aR145G+bF256R,aA186C+bS243C, bA306C+bV423C, aA173C+bB410C, bF24A+bF256R.Схема 3: 1 — матричная метилированная плазмида, 2 — праймеры с мутациями наматричной плазмиде, 3 — образование дочерней плазмиды, несущей мутацию, 4 — дочерняяплазмида с мутацией, после DpnI гидролиза матричной плазмиды.В соответствии со схемой 3 синтезировали два комплементарных праймера, содержащихмутацию в центре последовательности.
Проводили амплификацию полноразмернойплазмиды, с последующим удалением метилированной матрицы при помощи рестриктазыDpnI. В качестве исходной матрицы в зависимости от задач служила или плазмида с геномecПА ДТ или же с геном одной из ранее полученных мутантных форм. В некоторых случаяхмноготочечные мутанты получали одновременно в два раунда ПЦР, как это описано в пункте2.2.1.Подготовку праймеров осуществляли в соответствии с следующими требованиями:1) Прямой и обратный праймер отжигаются на одну и ту же последовательностьпо противоположным цепям плазмиды2) Длина праймера составляет 25-45 нуклеотидов913) Температура плавления праймеров: Tm=81.5+0.41(%GC)-675/N ≥ 78°C4) Желаемая мутация приходится на середину праймера, а расстояние до обоихконцов составляет 10-15 нуклеотидов5) Минимальный GC состав (%GC) не менее 40%6) На концах праймера находится не менее 2-х G/CВ приложении 3 представлены праймеры для секвенирования (3.1), мутагенеза (3.2), атакже фланкирующие праймеры (3.3).В качестве полимеразы использовали смесь High Fidelity PCR Enzyme Mix (HF), котораяоказалась более эффективной, чем рекомендуемая в [89] полимераза Pfu (рис.
29).Рисунок 29. Сравнение эффективности полимераз HF (1-я дорожка) и Pfu (2-я дорожка).Концентрацию праймеров, dNTP, матрицы, Mg2+ подбирали в отдельном эксперименте(рис.30). Было установлено оптимальное соотношение компонентов смеси (дорожка 6):концентрация праймеров - 0,1 мкМ; концентрация dNTP - 2мМ; концентрация матрицы - 10нг/мкл.92Рисунок 30. Оптимизация условий ПЦР.При проведении QuikChange ПЦР реакции для контроля качества ПЦР, а также дляапробацииновыхпраймероврекомендуетсянарядусцелевымПЦРпроводитьдополнительный при внесении фланкирующих праймеров (рис.31).Рисунок 31. Дополнительный ПЦР с фланкирующими праймерами.
Дорожка 1 – ПЦР безмутирующих праймеров, дорожки 2-7 – ПЦР с мутирующими праймерами.Схему ПЦР мутагенеза с перекрыванием (схема 4) использовали при получении мутантов:bQ292R,bN388Q,bF256R,bF24A,bA255R+bF71L,bF256R+bF71L,bN388Q+bF71L,bF24A+bF71L, bF256R+bS149R, bF256R+bN388Q+bF71L, bF24A+bF256R+bF71L. Данныемутанты, за исключением bQ292R, были получены к.х.н.
Ясной А.С.93Схема 4. 1 — прямой фланкирующий праймер, 1М — прямой мутирующий праймер,2 — обратный фланкирующий праймер, 2М — обратный мутирующий праймер.I: ПЦР-амплификация левого фрагмента (1+2M); II: ПЦР-амплификация правого фрагмента(2+1M); III: очистка и объединение фрагментов; достройка 3'-концов (V) и амплификацияцелого фрагмента (1+2).В соответствии со схемой 4 на область мутации синтезировали два праймера (ккодирующей и комплементарной цепям) так, чтобы их концы перекрывались и содержаливводимую мутацию.
Также использовали два фланкирующих праймера, комплементарныхпоследовательности гена по обе стороны от мутации и содержащие подходящие сайтырестрикции. В качестве исходной матрицы в зависимости от задач служила или плазмида сгеном ecПА ДТ или же с геном одной из ранее полученных мутантных форм.94Таблица 26. Сравнение методик мутагенеза.QuikChange ПЦР мутагенезПЦР мутагенез с перекрыванием- высокая скорость получения- возможность контроля на каждом этапе;мутантов (1 сутки до полученияДостоинстваклонов с мутациями);- низкая стоимость за счет меньшихрасходов на праймеры идополнительные ферменты;- низкий уровень ошибок;- возможность оптимизации протокола дляполучения многоточечных мутантов;- 100% выход после трансформации;- отсутствие необходимостииспользования электрофореза;- повышенная вероятность ошибкипри амплификации всего вектора;- низкий выход клонов, содержащихмутантную плазмиду.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
