Диссертация (Изменение клинических и иммунологических характеристик у больных с генерализованной формой миастении на фоне применения плазмафереза и озонотерапии), страница 7

На основании калибровочного графика влункахпослеизмерениявеличиныоптическойплотностираствораванализируемых образцах рассчитывается концентрация IgG.Проведение анализаВнести во все лунки планшета по 100 мкл рабочего раствора для разведениясывороток.Внести в соответствующиелункив дублях по 20 мклкаждойкалибровочной пробы и по 20 мкл контрольной сыворотки. В остальные лункивнести в дублях по 20 мкл анализируемых образцов в рабочем разведении.Планшет заклеить пленкой и инкубировать в течение 20 мин в шейкере при37 С и 700 об/мин.По окончании инкубации 5 раз промыть промывочным раствором лункипланшета, чередуя аспирацию и немедленное заполнение лунок каждого стрипа.В процессе каждого цикла промывки вносить в каждую лунку не менее 350 мклжидкости. После каждого заполнения необходимо полное опорожнение лунок.44По окончании промывки, постукивая перевернутым планшетом пофильтровальной бумаге, остатки влаги из лунок тщательно удалить.Внести во все лунки по 100 мкл конъюгата, заклеить планшет иинкубировать 20 мин.

в шейкере при 37 С и 700 об/мин.По окончании инкубации промыть планшет 5 раз.Внести во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, заклеитьпланшет и инкубировать в темноте 15 мин. при температуре 18-25С.Внести во все лунки по 100 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунококрашивается в желтый цвет.Измерить величину оптической плотности в течение 3-10 мин.Построить калибровочный график зависимости оптической плотности отконцентрации в калибровочных пробах.Определить содержание IgG в контрольной сыворотке и анализируемыхобразцах по калибровочному графику.ВслучаенеобходимодополнительногополученнуюразведенияконцентрациюIgанализируемыхGумножитьнаобразцовфактордополнительного разведения.1 мг/мл IgG соответствует 12,5 МЕ/мл IgG.2. Иммуноглобулин МИммуноглобулин М циркулирует в крови в виде пентамера с молекулярноймассой около 970 кДа.Иммуноглобулин М – это наиболее ранний из всехклассов иммуноглобулинов.

К этому классу относится 5-10% общего содержанияиммуноглобулинов сыворотки. Они агглютинируют бактерии, нейтрализуютвирусы, активируют комплемент.Количественное определение содержания иммуноглобулина общего классаМ в сыворотке крови имеет диагностическое значение при инфекционныхзаболеваниях. Повышение титров свидетельствует об остром воспалительномпроцессе.45Для определения концентрации общего иммуноглобулина класса Миспользовался набор реагентов IgМ общий-ИФА-БЕСТ.

Метод: твердофазныйиммуноферментный анализ.Набор рассчитан на проведение анализа в дублях 41 неизвестного образца, 6калибровочных проб и 1 пробы контрольной сыворотки при одновременномиспользовании всех стрипов планшета. Дробное использование набора можетбыть реализовано в пределах срока годности.Необходимое оборудование и последовательность манипуляций такие же,что и при определении концентрации IgG общего.На первой стадии калибровочные пробы с известной концентрацией IgМобщего и анализируемые образцы инкубируются в лунках стрипированногопланшета с иммобилизованными моноклональными антителами к мю-цепям Ig М.На второй стадии связавшийся в лунках IgМ обрабатывают конъюгатом МКАТ клегким цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой.При расчете концентрации IgМ применяется коэффициент пересчета 125:1 мг/мл IgМ соответствует 125 МЕ/мл IgМ.3.

Иммуноглобулин АIgА общий представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около160 кДа. Содержание IgА общего в сыворотке крови составляет 15-20% от общегоколичестваиммуноглобулинов.Основнаяфункциясывороточныхиммуноглобулинов класса А – защита дыхательных, мочеполовых путей ижелудочно-кишечного тракта от инфекций.Количественное определение содержания IgА общего в сыворотке кровиимеет значение для дифференциальной диагностики заболеваний печени,инфекционных заболеваний.Для определения концентрации общего иммуноглобулина класса Аиспользовался набор реагентов IgА общий-ИФА-БЕСТ. Метод: твердофазныйиммуноферментный анализ.46Набор рассчитан на проведение анализа в дублях 41 неизвестного образца, 6калибровочных проб и 1 пробы контрольной сыворотки при одновременномиспользовании всех стрипов планшета.

Дробное использование набора можетбыть реализовано в пределах срока годности.Необходимое оборудование и последовательность манипуляций такие же,что и при определении концентрации IgG общего.Припервой инкубации происходитисследуемогообразцассвязываниемоноклональнымимолекулыантителамикIgАизальфа-цепямиммуноглобулинов класса А человека, иммобилизованными на внутреннейповерхности лунок.Привторой инкубации конъюгат моноклональных антител к лямбда икаппа – цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой связывается с IgАобщим, иммобилизованным в ходе первой инкубации.При расчете концентрации IgА применяется коэффициент пересчета 71,4:1 мг/мл IgА соответствует 71,4 МЕ/мл IgА.4.

Определение фагоцитарной активности нейтрофиловПринцип методаВ основе метода лежит способность нейтрофилов периферической кровипоглощать микроорганизмы с последующим их разрушением, крупные вирусы,поврежденные клетки или частицы латекса.Оборудование и материалы:- микроскоп бинокулярный Биолам Ломо;- колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК – 2МП (ФЭК);- кюветы для ФЭК 10 мл;- камера Горяева;- центрифуга на 1000-2000 об/мин;-термостатируемыйшейкерорбитальноговидаподдерживающий температуру 37 С ( ShakerST-3 SkyLine);- одноразовые полистирольные пробирки;на700об/мин,47- одноразовые пробирки с гепарином;- VortexHeidolphREAX 2000;- дозаторы объемом 10, 100, 1000 мкл;- физраствор, концентрат латекса, краска по Романовскому.Проведение анализаПриготовление рабочего раствора латекса.Концентрат латекса взболтать.

Взять 10 мл физраствора, добавить 0,1 мллатекса, отмыть 2 раза центрифугированием по 10 мин в режиме 1000 об/мин,отобрать супернатант.Проверка концентрации рабочего раствора латекса.1 способ: к 0,8 мл физраствора добавить 0,02мл рабочего раствора латекса,внести в камеру Горяева, подсчитать количество частиц. В большом квадратедолжно быть 15-20 частиц (концентрацию регулировать разведениемвфизрастворе).2 способ: определение оптической плотности частиц с помощью измеренияна ФЭКе. Смотреть в кюветах по 10 мл при длине волны 590 нм противфизраствора. Оптическая плотность должна быть в пределах 1,5-2,3.В сухую пробирку с 2-3 каплями гепарина добавить 5 мл венозной крови,перемешать 5 сек на «Vortex», центрифугировать 5 мин в режиме 1000 об/мин.Осторожно отобрать супернатант.Собрать кольцо нейтрофилов.

Отмыть 2 раза физраствором по 5 мл,перемешать 5 сек на «Vortex», ценрифугировать 2 раза по 10 мин в режиме 1000об/мин.Методика рассчитана на пробы с концентрацией нейтрофилов 4,8-8,0 х10/л.Взять 0,1 мл рабочего раствора латекса, добавить 0,1 мл взвесинейтрофилов термостатировать при 37 С на шейкере в течение 30 мин.Центрифугировать 5 мин в режиме 1000 об/мин .Осторожно отобрать супернатант. Из осадка сделать мазок, окрасить поРомановскому.48Учет результатов осуществляется на микроскопе определением следующихпараметров:подсчет процента фагоцитирующих нейтрофилов (фагоцитарный индекс) отобщего их числафагоцитарное число (число Райта).

Это среднее количество микробов,поглощенных одним нейтрофилом крови.Характеризует поглотительнуюспособность нейтрофилов крови.5. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов на проточномцитофлуориметреПринцип методаВосновупроточнойцитофлюориметриизаложенопроведениефотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток. Для оценкиразмеров клеток и внутриклеточных структур применяли фотометрическиеканалы, а для изучения клеточных маркеров – флюоресцентный канал.

При этомиспользовались моноклональные антитела (МАТ), которые были помеченыразличными флюорохромными красителями к внутриклеточным и мембраннымкомпонентам клеток. После окрашивания клеток МАТ происходит специфическоесвязывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции,индуцированной излучением лазера. В проточном цитометре свет преобразуется вэлектрическиесигналы,которыеобрабатываются,ивконечномопределяется количественная величина каждого измеряемого параметра.Оборудование и материалы- проточный цитометр Cytomics FC 500 (BeckmanСoulter);- центрифуга на 1500-2000 об/мин;- термостат;- одноразовые полистирольные пробирки;- Vortex Heidolph REAX 2000;- дозаторы объемом 10, 100, 1000 мкл;- физраствор.итоге49Проведение анализа1. Для каждого образца крови маркируется необходимое количествоодноразовых полистирольных пробирок.2.

Внести по 50 мкл хорошо перемешанного образца на дно каждойпробирки.3. Добавить по 5 мкл моноклональных антител в каждую пробирку всоответствии с маркировкой, перемешать 5 сек на “Vortex”.4. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре в темноте. Перемешать5 сек на “Vortex”.5. Для лизиса эритроцитов в пробирки внести 250 мклOptilyse, перемешать5 сек на “Vortex”.6. Инкубировать 10 мин в термостате при 37С, перемешать 5 сек на“Vortex”.7.

Добавить 250 мкл физраствора в каждую пробирку.После настройки прибора, выбора программы исследования и проведенияизмерений, согласно инструкции, перейти к анализу полученных результатов.Исследование начинается с анализа данных распределения изучаемой клеточнойпопуляции по каналам светорассеяния и выделения лимфоцитарного гейта.Необходимо стремиться к тому, чтобы максимальное количество событийрасполагалось в правом нижнем квадранте.Учет результатов осуществляется па основании анализа 10000 событий ивыражается в процентах клеток, несущих данный антиген. При необходимости,зная лейкоцитоз и состав лейкоцитарной формулы, можно рассчитать абсолютноеколичество клеток, несущих тот или иной антиген.6.

Циркулирующие иммунные комплексыНаборреагентов«ЦИК-ХЕМА»предназначендляопределенияциркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови человека методомиммунного турбодиметрического анализа.50Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) образуются и циркулируют вкровяном русле в ответ на введение агента (антигена). Они представляют собойкомплексы, состоящие из антител, антигена и компонентов комплемента.Уровень циркулирующих иммунных комплексов дает определенноепредставлениеобактивностииммунноговоспаленияиэффективностипроводимой терапии [8]. Повышение уровня ЦИК отмечается при диффузныхболезняхсоединительнойткани,подостроминфекционномэндокардите,системных васкулитах, ВИЧ-инфекции, аутоиммунном гепатите, болезни Крона идр.