Б.Б. Дамаскин, О.А. Петрий, Г.А. Цирлина - Электрохимия, страница 55

Известно, что ферменты не только проявляют высокую се@лективность к связыванию определенного субстрата (илиопределенного класса субстратов), но к тому же катализируютлишь реакции определенного типа, иногда с высокой стереосе@лективностью. Селективность биосенсоров, как правило, вышеселективности химических сенсоров, основанных на супрамоле@кулярных элементах распознавания. Чувствительность афинногобиосенсора определяется константой равновесия процесса связы@вания. С другой стороны, константа связывания и чувствитель@ность трансдьюсера определяют предел обнаружения и рабочийдиапазон концентраций данного афинного сенсора. Процесс свя@зывания не должен быть полностью необратимым, чтобы остава@лась возможность регенерации сенсора для повторных измере@ний.

Важными параметрами биосенсоров являются также времяотклика (обычно от долей секунды до получаса) и минимальноевремя между двумя последовательными измерениями (время вос@становления).Основой для биосенсоров служат как электрохимические (по@тенциометрические, кондуктометрические, амперометрические,импедансометрические), так и оптические трансдьюсеры. Режеприменяются трансдьюсеры, работающие на других принципах(например, использующие резонанс кристалла кварца, поверхно@стные акустические волны, детектирование тепловых эффектовбиоэлектрокаталитических процессов).Примеры потенциометрических биосенсоров уже были рас@смотрены выше.

Такие биосенсоры могут быть реализованына основе ионоселективного электрода или полевого транзистора(см. рис. 6.12) путем нанесения биораспознающего элемента наионоселективный слой. Очень широко распространены такжебиосенсоры с амперометрическим трансдьюсером — устройства,регистрирующие зависимость электрического тока от концентра@ции аналита. Такой трансдьюсер был применен в первом электро@химическом биосенсоре — биосенсоре на глюкозу (С Апдайк,Дж. Хикс, 1967), созданном на основе электрода Кларка.

В этомбиосенсоре первого поколения использовалась катализируемая.288глюкозооксидазой (GOx) реакция генерации глюконовой кисло@ты и пероксида водорода:GOxГлюкоза + О2 БББВ Глюконовая кислота + Н2О2.Далее пероксид водорода регистрировали по току реакции окис@ления+–Н2О2 ББВ О2 + 2Н + 2е .Показания этого биосенсора зависели от флуктуаций кислорода всистеме, а из@за высокого значения потенциала окисления перок@сида водорода одновременно происходило окисление других ком@понентов системы.

Эти проблемы удалось преодолеть, используяявление катализа: во втором поколении глюкозных биосенсоровначали дополнительно применять различные медиаторные систе@мы, переносящие электроны от глюкозаоксидазы к электроду ипереводящие редоксцентр фермента в исходное соостояние. Про@стейшая схема работы такого биосенсора имеет вид:Глюкоза + GOx(ox) ББВ Глюконолактон + GOx(red);GOx(red) + 2Med(ox) – 2e– ББВ GOx(ox) + 2Med(red) +2H+;2Med(red) ББВ 2Med(ox) + 2e–,где Med — медиатор, а нижние индексы ox и red отвечают, соот@ветственно, окисленным и восстановленным формам фермента имедиатора.

В качестве медиаторов были испытаны различные ор@ганические и металлоорганические соединения, рутениевые ком@плексы, гексацианоферраты и другие редокс@системы. Чтобыизбежать медленной диффузионной доставки медиатора(шатл@механизм) к ферменту и к электроду, было предложено«пришивать» фермент к поверхности с помощью редокс@актив@ных полимеров или неорганических материалов. Обсуждаетсявопрос о возможности прямого переноса электрона с фермента наэлектрод (биосенсоры третьего поколения). Реализация этойидеи обычно требует модифицирования молекул фермента, в ча@стности, частичного удаления белковой оболочки, тормозящейпроцесс переноса электрона.

Еще один изящный путь усовершен@ствования биосенсоров состоит в химическом модифицированиифермента редокс@активным медиатором. Достигнутые в настоя@щее время характеристики глюкозных биосенсоров позволяютнадеяться на осуществление непрерывного мониторинга глюко@зы в реальном времени с использованием имплантируемых уст@ройств.Для разработки и совершенствования амперометрическихсенсоров необходимо знать закономерности электродных процес@289сов, в первую очередь процессов переноса электрона. Спецификаэтих процессов для ферментов состоит в реализации дальнего пе@реноса электрона (раздел 4.9), т.

е. процесса в условиях сравни@тельно слабого электронного перекрывания. Активные исследо@вания кинетики редокс@превращений металлопротеинов (к этомуклассу относятся и многие ферменты) в значительной степенистимулируются именно задачами биосенсорики.Особый интерес, особенно для клинических анализов, вызы@вают портативные мультисенсорные устройства, позволяющиепроводить быстрое определение нескольких метаболитов.6.11.

БиоэлектрохимияВ середине ХХ в. работы физиологов по исследованию нервно@го импульса и мышечных сокращений возбудили интерес к элек@трохимическим явлениям в живых системах, в частности, намембранах биологических клеток. Клеточные, или плазменныемембраны отделяют внутреннюю часть любой живой клетки отокружающей среды.

Составы растворов внутри и снаружи клетокразличны, а сами мембраны обладают избирательной проницае@мостью. В основе транспорта веществ через мембраны лежатэлектрохимические закономерности. Этот пример указывает наважность электрохимического подхода к исследованию биологи@ческих объектов. Изучение электрохимических закономерностейфункционирования живых систем и их моделей составляет пред@мет биоэлектрохимии. Это направление электрохимии интенсив@но развивается в настоящее время.

Один из разделов биоэлектро@химии связан с изучением мембран и их2роли в биологических системах.Схематическое строение клеточной3 мембраны показано на рис. 6.13. Мем@брана состоит из липидного бислоя 1, по@лярные группы 2 которого обращены на@4 ружу (липиды — макромолекулы,образованные из молекул жирных ки@слот). На внешних поверхностях мем@браны адсорбирован первичный слой 3белковых молекул, взаимодействие ко@торых друг с другом придает мембране1Рис.

6.13. Схема клеточ@ механическую устойчивость и проч@ной мембраны (пояснение ность. Мембраны пронизаны белковымив тексте)каналами 4, при помощи которых,290по@видимому, осуществляется селективный ионный транспорт.Раствор внутри клетки содержит относительно большие концен@++трации ионов К и низкие концентрации Na . В опытах с изото@+пом калия обнаружена способность внутриклеточных ионов К кпрактически полному обмену.

Окружающая клетку среда обога@щена ионами Na+.Разность потенциалов на клеточной мембране зависит от раз@ности концентраций ионов во внутренней части клетки и в окру@жающей ее среде, а также от проницаемости мембраны. Мем@бранные потенциалы нервных и мышечных волокон в состояниипокоя составляют 60–95 мВ.

Формально мембранный потенциалED подчиняется уравнениюED =( a + )iRTln K ,F( a + )0(6.10.1)Kгде ( a)K+ iи (a)K+ 0+— активности ионов К внутри и снаружи клетки со@ответственно.Методом радиоактивных индикаторов установлено, что мем@брана проницаема также для ионов Na+ и некоторых других ио@нов. При действии раздражителя на нервное или мышечное во@локно мембранное равновесие в месте раздражения нарушается.Это нарушение начинает распространяться вдоль волокна с при@близительно постоянной скоростью. В первый момент состояниявозбуждения резко возрастает проницаемость мембраны для ио@нов Na+, поток которых устремляется внутрь клетки.

Затем на@чинается движение К+ во внешнюю среду. Распространяющаясяпо волокну волна называется волной потенциала действия. Схе@матически распространение нервного импульса может быть смо@делировано на основе некоторых электрохимических систем, асамо явление можно феноменологически описать, если задатьсяэлектрической емкостью, сопротивлением утечки мембраны,формой нервного импульса и рассматривать явление как распро@странение электрического сигнала в кабеле с определенными па@раметрами.Развитие биоэнергетики — науки о биологической трансфор@мации энергии — показало, что биомембраны играют главнуюроль в механизме освобождения и потребления энергии в живыхсистемах.

Существует два основных процесса энергообеспечениятаких систем: фотосинтез и дыхание. У высших организмов про@цессы энергообеспечения локализованы на мембранах особыхкомпонентов клетки — митохондрий, которые служат своеобраз@ными «силовыми станциями», поставляющими энергию, необхо@291димую для функционирования клеток. Митохондрия окруженадвумя мембранами — внешней и внутренней. Ферментные ком@плексы, ответственные за энергообеспечение клетки, расположе@ны на внутренней мембране митохондрий. Аналогичную роль иг@рает клеточная мембрана аэробных бактерий. У зеленыхрастений трансформация энергии происходит на мембранах ти@лакоидов хлоропластов, а у фотосинтезирующих бактерий — намембранах хроматофоров.

Увеличение ионной проводимостимембран приводит к рассеиванию энергии в виде теплоты, а раз@рушение мембран — к полной потере способности к аккумуляцииэнергии.Долгое время считалось, что накопление и использованиеэнергии в живых системах происходит только с участием адено@зинтрифосфата (АТФ). При передаче энергии АТФ переходит ваденозиндифосфат (АДФ), который затем за счет разных видовэнергии присоединяет фосфатную группу и превращается снова вАТФ. Процесс образования АТФ называется фосфорилировани'ем, он сопряжен с окислительными процессами, возникающимив клетках при дыхании или при фотосинтезе.В 1961 г. английский биохимик П.