Диссертация (Экспериментальное обоснование комплексной стимуляции репаративно-регенеративных процессов при повреждении седалищного нерва), страница 4

Барабаша (Саратов, 2016); 3-йВсемирный Конгресс «Controversies in Thrombosis and Hemostasis» совместнос 8-й Всероссийской конференцией по клинической гемостазиологии игемореологии (Москва, 2016).1718Публикации результатов исследованияПо теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 5 в журналах,включенных в перечень периодических научных и научно-практических изданий,рекомендованныхВАКМинобрнаукиРФдляпубликациирезультатовдиссертационного исследования на соискание ученой степени кандидатамедицинских наук; получен патент РФ на изобретение (№2587719, опубл.20.06.16. – Бюл. № 17), патент РФ на полезную модель (№145447, опубл. 20.09.14.– Бюл.

№ 26) и свидетельство о регистрации программы для ЭВМ (№ 2015616501,опубл. 20.07.2015. – Бюл. №7).Объем и структура диссертацииДиссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоитиз введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 3 глав результатовсобственных исследований, обсуждения результатов, заключения и выводов.Работа иллюстрирована 11 рисунками и 20 таблицами. Библиографическийсписок содержит 282 литературных источников, из них 72 отечественных и 210зарубежных.1819Глава 1 Регенерация поврежденных периферических нервови способы ее стимуляции (обзор литературы)1.1 Патогенез дегенеративных изменений, возникающих при повреждениипериферического нерваВосстановлениеповрежденныхнервныхволоконсложныйпроцесспретерпевающий несколько стадий.

Изначально вызванное травматическимповреждениемнарушениеанатомическойцелостностинервноговолокнаинициирует развитие дегенеративных процессов, как непосредственно вповрежденном нерве, так и в окружающих его тканях [M. Kerschensteiner et al.,2005]. В дистальном отрезке нерва развивается валлеровская дегенерация (ВД),характеризующаяся непродолжительным латентным периодом с последующейфрагментацией аксонов и деградацией миелиновой оболочки [S. Saxena et al.,2007; S. Rotshenker, 2011; R. Villegas et al., 2012; E. Ydens et al., 2012].

ВД такжевключает в себя реакции глии, фибробластов, иммунных клеток, и протекает как вцентральной, так и в периферической нервной системе, причем в центральнойнервной системе прогрессирование ВД происходит с меньшей скоростью[M. Vargas et al., 2007; B.S. Mietto et al., 2011; A.

DeFrancesco-Lisowitz et al., 2015;B.S. Mietto et al., 2015; H. Peluffo et al., 2015].Фрагментацию аксонов при световой микроскопии можно наблюдать через36 часов после пересечения нерва у мышей и крыс, в то время как у обезьянданное явление наблюдается только через неделю. Скорость ВД также зависит отдлины и диаметра дистального аксона [B.

Beirowski et al., 2005; S. Rotshenker,2011]. Некоторые авторы считают, что разрушение аксонов происходит врезультате кальций-зависимого протеолиза после повреждения мембран аксонов спервых минут и в последующие несколько часов [M.Coleman et al., 2002]. Приувеличении концентрации свободного внутриклеточного кальция происходитактивация Са2+-зависимой нейтральной протеиназы – кальпаина, развиваютсямитохондриальныедисфункции.Кальпаин19расщепляетальфа-субъединицы20натриевых каналов, большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белкимикротрубочек. Так же кальпаин способен расщеплять основной белок миелина,вызывать апоптоз нейронов.

Увеличение кальция в митохондриях приводит кусилению продукции активных форм кислорода, в том числе супероксидногорадикала, что может приводить к гибели клетки [M. Wang et al., 2004; M.A.Nikolaeva et al., 2005; E. Touma et al., 2007; D. Stirling et al., 2010].Эндогенным триггером развития ВД многие исследователи считают белокNmnat (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase), аксональный транспорткоторого нарушается при пересечении аксона [L. Conforti et al., 2006; M. Avery etal., 2009; Y.

Sasaki et al., 2009; J. Gilley et al., 2010]. В исследовании на мутантныхмышах с замедленной ВД было установлено, что сверхэкспрессия Nmnatприводит к защите аксонов и замедлению их фрагментации. Ингибированиеубиквитин-протеасомной системы приводит к истощению запасов Nmnat даже внеповрежденных аксонах, и способствует развитию ВД. [T. Mack et al., 2001;M.

Avery et al., 2009; E. Babetto et al., 2010; B. Kitay et al., 2013].Деградация миелиновой оболочки происходит под действием фосфолипазыА2 (phospholipase-A2, PLA2), экспрессия которой в свою очередь регулируетсяцитокинами и хемокинами шванновских клеток, такими как MCP-1 (monocytechemoattractant protein-1), TNF-α (tumor necrosis factor), Интерлейкин-1β [S. De etal., 2003; A. George et al., 2004a; V. Shubayev et al., 2006; K.

Temporin et al., 2008a].Цитозольные и секретируемые формы PLA2 гидролизируют фосфолипидымембраны с образованием арахидоновой кислоты и лизофосфотидилхолина,который вызывает распад миелина [P. Larsen et al., 2003; R. Martini et al., 2008].Так же было установлено, что при блокировании экспрессии и активности PLA2время очищения от остатков миелина значительно увеличивается [S. De et al.,2003]. В деградирующем миелине содержатся молекулы способные ингибироватьрост аксонов, такие как MAG (myelin associated glycoprotein) и OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein) [V.

Kottis et al., 2002; H. Meyer zu et al., 2008;L. McKerracher et al., 2015]. Уменьшение скорости очищения очага поражениянервнойтканиотпродуктовраспада20негативновлияетнаразвитие21восстановительных процессов [E. Babetto et al., 2010; M. Coleman et al., 2010;A. Gaudet et al., 2011]. Своевременная утилизация распадающегося миелинапредотвращает развитие вторичного повреждения интактных аксонов и миелинамембраноатакующими комплексами комплемента [R. Mead et al., 2002;V. Ramaglia et al., 2007]. Фагоцитоз фрагментов дегенерирующих аксонов имиелиновой оболочки осуществляется шванновскими клетками и макрофагами, изанимает период времени от двух до трех недель. [W.

Campana et al., 2007;K. Jessen et al., 2008; P. Arthur-Farraj et al., 2012; M. Richner et al., 2014].Первыми на повреждение нерва реагируют шванновские клетки, активациякоторых происходит при взаимодействии некоторых эндогенных лигандов,в норме не присутствующих во внеклеточной среде, таких как белков тепловогошока, компонентов внеклеточного матрикса и tool-рецепторов (toll-like receptor,TLRs) шванновских клеток. [K. Kariko et al., 2004; G. Brunn et al., 2005; D.

Willis etal., 2007; A. Asea, 2008; S. Goethals et al., 2010]. В экспериментальныхисследованиях было показано, что при добавлении некротизированных нейронов,содержащих предположительно лиганды TLRs, в культуру шванновских клетокпроисходит увеличение выработки TNF-α, индуцибельной синтазы оксида азота,MCP-1 [S.

Karanth et al., 2006; A. Boivin et al., 2007; I. Pineau et al., 2009].Некоторые авторы считают, что основным регулятором активации шванновскихклеток является транскрипционный фактор c-Jun, селективная инактивациякоторого приводит к замедлению регенеративных процессов в поврежденномнерве [P. Arthur-Farraj et al., 2012]. Так же, помимо c-Jun N-концевой киназы,определенную роль в активации шванновских клеток играют внеклеточнаярегулирующая киназа (extracellular signal-regulated kinase, ERK), р38 митогенактивирующая протеинкиназа [M. Feltri et al., 2002; M.

Jaegle et al., 2003;S. Atanasoski et al., 2004].При перерезке седалищного нерва у мышей в дистальном отрезке в течениепервыхпятичасовувеличиваетсяпродукцияшванновскимиклеткамипровоспалительных цитокинов – TNF-α, Интерлейкин-1α, Интерлейкин-1β,LIF (leukemia inhibitory factor), производство MCP-1 и MIP-1α (macrophage2122inflammatory protein) достигает максимума к первым суткам после повреждения[S.

Shamash et al., 2002; H. Lee et al., 2009; E. Ydens et al., 2012; A. Brosius Lutz etal., 2014; K. Kegler et al., 2015]. Впоследствии эти цитокины стимулируютдополнительнуюиммунныхэкспрессиюмедиаторов,шванновскимитакихкакклеткамииИнтерлейкин-6,фибробластамигранулоцитарно-макрофагальный колоний-стимулирующий фактор, интерлейкин-10 [H. Taskinenet al., 2000; M. Subang et al., 2001; S. Shamash et al., 2002; F. Perrin et al., 2005].Также было обнаружено что TNF-α способен вызывать пролиферациюфибробластов, и индуцировать таким образом образование невриномы, что можетприводить к ухудшению функционального восстановления нервов, а присвязывании с TNF-R1 рецептором оказывать и нейротоксическое действие[W.

Chadwick et al., 2008; K. Frankola et al., 2011]. Кроме этого, в течение 48 часовпослетравмы,окружающиетравмированныйнервшванновскиеклеткипрекращают выработку белков миелина [A. Guertin et al., 2005; B. Murinson et al.,2005].Секреция шванновскими клетками провоспалительных цитокинов вызываетактивацию резидентных макрофагов, привлечение циркулирующих макрофагов вочаг повреждения. Резидентные макрофаги пролиферируют и подвергаютсяморфологическимизменениям.ФормирующийсяприэтомфенотипМ1макрофагов способствует развитию и поддержанию воспалительного процесса,так как клетки данной популяции являются продуцентами провоспалительныхцитокинов, окислительных метаболитов – оксида азота и супероксид- аниона[H.

Lee et al., 2009; E. Ydens et al., 2012; A. Brosius Lutz et al., 2014; K. Kegler et al.,2015]. MCP-1 и MIP-1α способствуют привлечению циркулирующих макрофагов.Также, одним из факторов, привлекающим в зону повреждения циркулирующиемакрофаги, является Галектин-1, продуцируемый шванновскими клетками,резидентными макрофагами в течение трех суток после повреждения [J. McGrawet al., 2004; A. Gaudet et al., 2005].Некоторые авторы рассматривают дегенерацию и утилизацию продуктовраспаданервноговолокнакакстадийный22процесс,характеризующийся23изменениями цитокинового баланса. Так на первом этапе ВД преобладаютпровоспалительные цитокины, такие как Интерлейкин-1α, TNF-α, Интерлейкин1β, секретируемые в основном резидентными макрофагами и шванновскимиклетками. На втором этапе преобладают противовоспалительные цитокины, такиекак Интерлейкин-10, секретируемые привлекаемыми макрофагами в очагвоспаления [M.