Диссертация (Экспериментальное обоснование комплексной стимуляции репаративно-регенеративных процессов при повреждении седалищного нерва), страница 9

Хавинсон и др., 2005, 2009; Л.И. Анохова и др., 2011].4041Срединепептидныхтрансплантируемойтканистимуляторов,можнокоторыевыделитьмогутнескольковыделятьсягруппизвеществ.Стимулирующим действием обладают также и компоненты межклеточногоматрикса, в частности олигосахариды гиалуроновой кислоты, в большомколичестве содержащейся в коже [M. Bhatia et al., 2007; F. Gao et al., 2010].Например, развитие регенерационных процессов в кожной ране у крысстимулироваливведениемтканевогоэкстрактагетерогеннойкожи,чтоотражалось в ускоренной эпителизации ран и активации дермальных элементов сформированием относительно меньшего рубца [Е.В. Кадилов, 1977; В.И.

Ноздрини др., 2006].Следует отметить, что трансплантированная ткань оказывает влияние нарезидентные ткани в данной области, что приводит к ряду структурнофункциональных реакций со стороны последних. В частности, альтерация тканейиндуцирует процессы регенерации, что приводит к продукции различныхбиологически активных веществ в области поражения, которые могут всасыватьсяв кровь и оказывать системные эффекты.

Такой подход реализуется в методахлеченияиспользующихстимуляциикровотока,определенныйрегенерации,объеммеханическойобменныхтравмыпроцессов.дляАктивацияиммунокомпетентных клеток при воспалении, вызванном альтерацией тканей,приводит к синтезу большого количества биологически активных веществ –цитокинов, факторов роста и других веществ. Также на системном уровнеальтерация тканей может приводить к мобилизации стволовых клеток,обладающих регенеративными эффектами [В.У. Галимова и др., 2007].Помимо участия биологически активных веществ, содержащихся втрансплантатах, в реализации стимулирующих эффектов, определенную рольиграют и реакции иммунитета в зоне трансплантации.

Привлекаемые клеткииммунной системы являются источниками большого количества биорегуляторовкак местного, так и системного воздействия. Недавние исследования показали,что в месте имплантации аллогенного биоматериала, основу которого составляеткадавернаяткань,происходитконцентрация41мононуклеарныхклеток-42предшественников, среди которых преобладают гематопоэтические стволовыеклетки костномозгового происхождения. При этом по мнению авторов, ключевымфактором, влияющим на характер межклеточных взаимодействий, являетсяфенотипическая зрелость и активность макрофагов [Е.А. Монастырская и др.,2008; Э.Р.

Мулдашев и др., 2014]. В исследованиях с применением дермальногоаллотрансплантата при посттравматической субатрофии глазного яблока всыворотке крови и слезной жидкости отмечается увеличение концентрациистабильных метаболитов оксида азота, являющегося мощным вазодилатирующимсредством [В.У. Галимова и др., 2007].Такимобразом,тканевыетрансплантатыможноиспользоватькак источники биологически активных веществ, так и как активатор иммунныхклеток, которые в свою очередь являются также продуцентами биологическиактивныхвеществ.Внастоящеевремяиспользуютсяпреимущественноаллоткани. Однако их использование сопряжено с необходимостью проведениясоответствующейобработки,консервации,атакжерискоминфекционных и иммунных осложнений.

В этой связиразвитияпредставляетсяперспективным использование собственных тканей с целью биостимуляции.Многие аспекты механизмов реализации биостимулирующих эффектов прииспользовании трансплантатов на сегодняшний день не ясны, что обусловливаетнеобходимость исследований в данной области.4243Глава 2 Материалы и методы исследований2.1 Организация экспериментов с лабораторными животнымиИсследования проведены на 92 белых нелинейных крысах-самцах массой180-220 г., разделенных на 5 групп:1. Ложнооперированныеживотные,которымвыполнялсядоступкседалищному нерву без его пересечения.2. Животные,которымпроводилосьхирургическоевмешательство,включающее доступ к седалищному нерву, его пересечение и последующуюнейрорафию.3.

Животные, которым выполнялась нейрорафия и аутотрансплантацияполнослойного кожного лоскута (АТПКЛ) в межлопаточную область.4. Животные, которым одновременно с нейрорафией выполнялась АТПКЛ иимплантация электродов с последующей прямой электростимуляцией (ПЭС)седалищного нерва.5. Животные, которым выполнялась АТПКЛ в межлопаточной области.Количество животных в группе при каждом конкретном исследованииопределялось вариабельностью исследуемого показателя, чувствительностьюи специфичностью методики и варьировало от 6 до 16 случаев.Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях на базевивария ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университетим.

Н.И. Вавилова» Министерства сельского хозяйства РФ, обеспечивалисьсбалансированнымпищевымрациономиводой.Экспериментальныеисследования проводились в отдельной лаборатории, исключающей посторонниераздражители, при постоянной температуре воздуха 18-22°С, со стандартнымуровнем освещения и влажности.При выполнении эксперимента соблюдались все условия, предусмотренныеХельсинской декларацией (1964) и документом «Положение об использованииживотных в биомедицинских исследованиях», принятым 41-й Генеральной4344АссамблеейВсемирноймедицинскойассоциации(1989),вкоторыхрегламентированы этические моменты проведения экспериментов на животных.При работе с экспериментальными животными руководствовались требованиямиприказа Министерства здравоохранения РФ от 23 августа 2010 года № 708 н«Об утверждении Правил лабораторной практики».Передвыполнениемманипуляцийвсемживотнымвводиласьвнутримышечно комбинация золетила («VirbacSanteAnimale», Франция) в дозе0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг для достижениянаркоза.

Выведение животных из опыта осуществляли путём передозировкипрепаратов для наркоза.2.1.1 Методика нейрорафии седалищного нерва у животныхУ животных после обработки операционного поля осуществлялся доступ кседалищномунервуиегоинтраоперационнаяфиксацияспециальноразработанным устройством (Пат. №145447, опубл. 20.09.14. – Бюл. № 26),которое представляет собой горизонтально вытянутую углообразную площадку.В верхних краевых углах боковых стенок площадки выполнены сквозныеотверстия для крепления устройства в ране.

По периферии одной из боковыхстенок вдоль ее продольной стороны на внутреннюю поверхность нанесенамиллиметровая разметка. В боковых стенках площадки выполнено по двагоризонтально расположенных параллельных ряда сквозных отверстий собеспечением прохода через них лигатур для фиксирования положения нерва.Даннаяполезнаямодельпозволяетпрочноатравматичноудерживатьпериферический нерв во время осуществления хирургических манипуляций.После фиксации нерва в указанном устройстве на уровне средней третибедра производилось его полное поперечное пересечение.Нейрорафияосуществляласьнепосредственнопослеперерезкиседалищного нерва путем наложения эпиневральных швов с применениематравматических игл и шовного материала 7/0 или 8/0 USP.44452.1.2 Методика аутотрансплантации полнослойного кожного лоскутав межлопаточную областьВыбормежлопаточнойобластидляаутотрансплантацииобусловленособенностью экспериментов на животных.

Так существует необходимостьзащиты послеоперационной раны от самого животного, от внешних воздействий,в том числе и от контаминации раны микрофлорой на подстилочном материале.Межлопаточная область имеет ряд анатомических преимуществ для выполненияоперативного вмешательства, дальнейшего визуального осмотра и мониторингамикроциркуляторных изменений. Кроме того, в данной области подкожножировая клетчатка рыхлая, с хорошо развитой микроциркуляторной сетью.Для АТПКЛ в межлопаточной области на депилированном участке кожи(Рис.

1.) в асептических условиях иссекался полнослойный кожный лоскутразмером 0,1% от площади поверхности тела. Расчет размера кожного лоскутапроводился отдельно для каждого животного.Для расчета площади поверхности кожи крысы использовали формулу,предложенную M. Lee в 1929 г. (по Н.И. Кочетыгову,1964):S = K x W0,66,где S – поверхность тела, см²; K – 9,1 (постоянный коэффициент); W — массатела животного в граммах.Средняя площадь кожного лоскута составила 30 (27; 34) мм2.С целью удаления разрушенных клеток и дезинфекции иссеченногокожного лоскута осуществлялась поочередная обработка 3%-ным растворомперекиси водорода с экспозицией 1 минуту, 70%-ным этиловым спиртом сэкспозицией 30 секунд и изотоническим раствором хлорида натрия с экспозицией2 минуты. Далее в ране формировался подкожный карман, в который помещалсяпредварительно обработанный лоскут.

Рана ушивалась послойно наглухо(Рис 2. В).4546Рисунок 1 – Этапы АТПКЛ: А – подготовка операционного поля; Б – иссечениеполнослойного кожного лоскута; В – ушивание раны2.1.3 Методика прямой электростимуляции седалищного нерваДляимплантацииактивныхконцовэлектродовкдистальномуипроксимальному отделам поврежденного нерва на расстоянии порядка 10 ммвыше и ниже зоны нейрорафии эпиневрально подводили освобожденныеот изоляции на протяжении не менее 2-5 мм участки многожильных проводовдиаметром порядка 0,5 мм. Расстояние между активными концами электродовсоставляло около 20 мм. Во избежание перемещения электродов по стволу нерваили потери контакта с нервным стволом электроды фиксировали к эпиневрию спомощью атравматических игл и шовного материала 7/0 или 8/0 USP. Свободныеконцы проводов выводили наружу, на поверхность кожного покрова к источникуэлектрических сигналов, фиксируя их на ней.Стимуляцию нервного ствола осуществляли в период с 3-х по 21-е сутки всвязистем,чтопомнениюрядаавторовцелесообразноначинатьэлектростимуляцию в период от 3-х до 7-х суток после нейрорафии [В.Г.

Нинельи др., 2012; Y.S. Chen, 2011]. Стимуляцию проводили при помощи аппарата«Миоволна» (рег. удостоверение № ФСР 210/06873 от 01.03.2010г.) с амплитудойстимулирующеготока0,5-2,0мА,взависимостиотпорогаболевойчувствительности. Для стимуляции использовали биполярные электрические4647импульсыдлительностью0,1мспрямоугольнойформы,являющиесяоптимальными для стимуляции периферических нервов [Л.И. Калакутский и др.,2012]. Частота стимулирующих импульсов составляла 25-30 Гц, в связи с тем, чтос одной стороны было продемонстрировано стимулирующее влияние частоты 20Гц на регенерацию нервных волокон у белых крыс при травматическихповреждениях седалищного нерва [A.