Диссертация (Экспериментальное обоснование комплексной стимуляции репаративно-регенеративных процессов при повреждении седалищного нерва), страница 10

English et al., 2007; Y.S. Chen, 2011;N. Thompson et al., 2014], с другой стороны - диапазон частот использовался дляснижения выраженности адаптации двигательного аппарата к процедуре иувеличения стимулирующего эффекта электростимуляции [З.В. Межевич, 2009;В.А. Сафроненко и др., 2015]. Продолжительность электростимуляции составляла20 минут 3 раза в день (во временные интервалы 8-10 часов, 13-15, и 18-20), всвязи с тем, что согласно данным литературы оптимальная продолжительность от15 минут до часа 1 часа, а превышение этого временного интервала вызываетразвитиеутомлениявнервныхволокнахиснижениеэффективностиэлектростимуляционного воздействия [В.А. Сафроненко и др., 2015; N. Thompsonet al., 2014].2.2 Объекты исследования2.2.1 Объекты исследования микроциркуляции кожиИсследование микроциркуляции и механизмов ее модуляции проведено у74 белых крыс-самцов, разделенных на 5 групп:I группа (n=12) – группа ложнооперированных животных, которымвыполнялся доступ к седалищному нерву без его пересения.II группа (n=15) – группа сравнения включала животных, которымпроводилась нейрорафия седалищного нерва.III группа (n=15) – группа включала животных, которым выполняласьАТПКЛ в межлопаточной области одновременно с нейрорафией седалищногонерва.4748IV группа (n=16) – животные, которым на фоне нейрорафии проводиласькомплексная стимуляция, включающая сочетание АТПКЛ и ПЭС.Vгруппа(n=13)–животные,которымвыполняласьАТПКЛв межлопаточной области без повреждения седалищного нерва.2.2.2 Объекты электронейромиографического исследованияС целью оценки динамики восстановления проводимости через зонунейрорафии седалищного нерва, а также активности процессов реиннервации вмышцах оперированной конечности были исследованы ЭНМГ-показатели 59животных, разделенных на 4 группы.I группа (n=12) – группа контроля, включающая ложнооперированныхживотных, у которых производилась регистрация ЭНМГ-показателей.II группа (n=31) – группа сравнения включала животных, которымпроводилась перерезка и нейрорафия седалищного нерва.III группа (n=8) – группа включала животных, которым выполняласьАТПКЛ в межлопаточной области одновременно с нейрорафией седалищногонерва.IV группа (n=8) – группа животных, которым на фоне нейрорафиипроводилась комплексная стимуляция, включающая сочетание АТПКЛ и ПЭС.2.2.3 Объекты морфологического исследованияДля изучения направленности регенеративно-дегенеративных процессов воперированном нерве изготавливали гистологические препараты участка нервадлиной от 15 до 20 мм, включавшего зону нейрорафии, маркируя проксимальныйи дистальный его отрезки.

Исследовании гистологии поврежденного нервногоствола выполнено у 43 животных:I группа (n=15) – группа сравнения включала животных, которымпроводилась перерезка и нейрорафия седалищного нерва.II группа (n=12) – группа включала животных, которым выполняласьАТПКЛ в межлопаточной области одновременно с нейрорафией седалищногонерва.4849III группа (n=16) – группа животных, которым на фоне нейрорафиипроводилась комплексная стимуляция, включающая сочетание АТПКЛ и ПЭС.С целью оценки структуры трансплантата и окружающих его мягкихтканей, а также динамики клеточных популяций дермы проводили заборкомплекса мягких тканей в межлопаточной области у животных без повреждениянервного ствола, которым выполнялась АТПКЛ.

В качестве контроля дляморфологического анализа зоны аутотрансплантации использовался комплексмягких тканей, полученный от группы ложнооперированных животных (n=12).2.2.4 Объекты биохимического исследованияСцельюопределениясодержаниявсывороткеконцентрацийнейротрофина-3 (NT-3), и тяжелого полипептида нейрофиламентов (NEFH)производился забор крови у 61 животных:I группа (n=11) – группа контроля включала интактных животныхII группа (n=15) – группа сравнения включала животных, которымпроводилась перерезка и нейрорафия седалищного нерва (n=9 на 7-е сутки, n=6 на21-е сутки).III группа (n=19) – группа включала животных, которым выполняласьАТПКЛ в межлопаточной области одновременно с нейрорафией седалищногонерва (n=9 на 7-е сутки, n=10 на 21-е сутки).VI группа (n=16) – животные, которым на фоне нейрорафии проводиласькомплекснаястимуляция,включающаясочетаниеАТПКЛиПЭС(n=8 на 7-е сутки, n=8 на 21-е сутки).С целью определения содержания в сыворотке концентраций фактора ростаэндотелия сосудов (VEGF) производился забор крови у 59 животных:I группа (n=7) – группа контроля включала интактных животныхII группа (n=12) – группа сравнения включала животных, которымпроводилась перерезка и нейрорафия седалищного нерва (n=6 на 7-е сутки,n=6 на 21-е сутки).4950III группа (n=15) – группа включала животных, которым выполняласьАТПКЛ в межлопаточной области одновременно с нейрорафией седалищногонерва (n=7 на 7-е сутки, n=8 на 21-е сутки).VI (n=14) – животные, которым на фоне нейрорафии проводиласькомплекснаястимуляция,включающаясочетаниеАТПКЛиПЭС(n=7 на 7-е сутки, n=7 на 21-е сутки).V (n=11) – животные, которым выполнялась АТПКЛ в межлопаточнойобласти (n=5 на 7-е сутки, n=6 на 21-е сутки).2.3 Методы исследования2.3.1 Методы исследования микроциркуляцииИсследованиемикроциркуляциипроводилосьметодомлазернойдопплеровской флоуметрии (ЛДФ) с помощью компьютеризированного лазерногоанализатора микроциркуляции крови «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма»,Россия) с использованием программы LDF 3.0.2.395 и и разработанногопрограммного обеспечения (№ 2015616501, опубл.

20.07.2015. – Бюл. №7.)Перед регистрацией ЛДФ-граммы проводилась проверка «нулевого»показания анализатора. Для этого рабочий торец зонда с насадкой устанавливалсяперпендикулярно внутренней поверхности белого диска из фторопласта,вращением ручки «уст.

нуля» на передней панели добивались нулевого показанияна индикаторном табло. Проверка «нулевого» показания анализатора «ЛАККОП» проводилась с целью повышения достоверности получаемых результатов.Металлическая насадка со световодным зондом фиксировалась на области холкиживотного, непосредственно над зоной АТПКЛ и над кожей тыльной поверхностистопы оперированной конечности помощи атравматического пластыря (рис. 2).Изменения потока крови в микроциркуляторном русле кожи животногорегистрировались в виде кривой (ЛДФ-граммы), отображаемой на экранемонитора компьютера, сопряженного с анализатором «ЛАКК-ОП». Длительностьстандартной записи составляла 8 минут.5051Рисунок 2 – Варианты положения световодного зонда при регистрации ЛДФграмм: А – на коже тыльной поверхности стопы; Б – в межлопаточнойобласти (область АТПКЛ)Регистрацию ЛДФ-грамм выполняли у животных 1, 2, 3 и 4-й групп,описанных в разделе 2.2.1.

У животных 1-й группы проводили оценкумикроциркуляции кожи тыльной поверхности стопы оперированной конечностина 7-е, 14-е и 21 сутки эксперимента. У животных 2-й и 3-й группы проводилиоценку микроциркуляции кожи тыльной поверхности стопы оперированнойконечности и области АТПКЛ на 14-е и 21-е сутки после оперативноговмешательства. У животных 4-й группы регистрацию ЛДФ-грамм с кожи областиАТПКЛ выполняли на 7-е, 14-е и 21-е сутки эксперимента.

В качестве контроляиспользовали ЛДФ-граммы с кожи межлопаточной области и тыльнойповерхности стопы соответственно, зарегистрированные у ложнооперированныхживотных до проведения манипуляций. Типичный вид кривых, отражающих5152изменение потока крови в микроциркуляторном русле у интактных белых крыс,представлен на рисунке 3.Рисунок 3 - Кривая изменения перфузии микроциркуляторного русла кожи(ЛДФ-грамма) интактного крысы-самца.Расчет параметров базального кровотока проводился в два этапа. На первомэтапе рассчитывали показатель перфузии (М) – величина среднего потока кровив интервалах времени регистрации или среднее арифметическое значениеперфузии в перфузионных единицах (пф.ед.).На втором этапе проводился амплитудно-частотный анализ ЛДФ-граммы.Амплитудно-частотныехарактеристикиосцилляцийкровотокавмикроциркуляторном русле кожи экспериментальных животных определяли наосновевейвлет-анализа,реализованноговпрограммномобеспеченииLDF 3.0.2.395.Типичный вид графиков, отражающих спектральные характеристикиосцилляций кровотока в микроциркуляторном русле кожи интактных крыссамцов, представлен на рисунке 4.5253Рисунок 4 - Спектральные характеристики осцилляций кровотокав микроциркуляторном русле кожи интактного крысы-самца.Приизученииактивныхмеханизмовмодуляциимикроциркуляциис помощью спектрального вейвлет-анализа оценивали величины пиковых частотнормированных амплитуд осцилляций в эндотелиальных (0,01-0,076 Гц),нейрогенных(0,076-0,2Гц)имиогенных(0,2-0,74Гц)диапазонах[А.И.

Крупаткин, 2013; В.В. Александрин, 2014; А.Н. Иванов и др., 2014b;A. Humeau et al., 2004]. Расчет нормированных амплитуд колебаний по формулеА/3σ*100 (где А – амплитуда колебаний, σ – среднеквадратическое отклонениеколебаний перфузии, средняя модуляция кровотока) с помощью программы LDF3.0.2.395. Интерпретация результатов проводилась в соответствии с трактовками,изложенными в литературе [А.И. Крупаткин и др., 2005].53542.3.2 Методы исследования электрофизиологических показателейЭлектронейромиографические исследования проведены на электромиографе«Keypoint» фирмы Alpain Biomed с набором стандартных стимулирующих ирегистрирующих электродов.