Диссертация (Свободные и координированные ионами Pt(II), Pd(II) тетразолилуксусные кислоты как перспективные скаффолды в синтезе новых биологически активных веществ), страница 11

На основанииполученных данных рассчитывали 50% эффективную концентрацию (EC50),т.е. концентрацию препарата, снижающую вирусную продукцию вдвое ииндекс селективности SI – отношение CTD50 к ED50.Исследованиефармацевтическойпроводилосьхимиив«ИнститутетехническогомедицинскойуниверситетаиБрауншвейха».Антипролиферативные эффекты на клетках HT-29, MDA-MB-231 и RC-124оценивали через 72 часа (HT-29), 96 ч (MDA-MB-231), 96 ч (RC-124) сиспользованием кристалл фиолетового реагента. Клетки HT-29, MDA-MB231 и RC-124 выдерживали в клеточной культуральной среде (дополненная2,2 г NaHCO3, 110 мг L-1 пируватом натрия и 50 мг L-1 гентамицинасульфата, рН 7.4), содержащую 10% (V/V) фетальной телячьей сывороткипри 37 ° С в 5% СО2.

Для экспериментов использовали свежеприготовленныерастворы соединений.Исходные комплексы растворялив ДМФА иразбавляли культуральной средой до рабочих концентраций (0,1% ДМФА).Значение IC50 определялось как концентрация, уменьшающая пролиферациюнеобработанных контрольных клеток на 50%.2.12. Биологические эксперименты для соединений(анализ клеточной культуры и цитотоксичности в клетках MCF-7)Культураклеток.Исследованиецитотоксическойактивности,клеточного цикла и колориметрические тесты для оценки метаболическойактивности клеток были проведены в «Научно-исследовательском институтебиомедициинской химии им. В.Н.

Ореховича».Раковые клетки рака молочной железы MCF-7 были получены изколлекцииАТСС,ибылисохраненывкриобанкедонастоящихэкспериментов. Клетки MCF-7 культивировали в среде Игла в модификацииДульбекко (DMEM). К среде была добавлена 10% эмбриональная телячьясыворотка (FBS) («Sigma», США), L-глутамин («Sigma», США) (250 мг/л),пенициллин (100 ед/мл), стрептомицина (100 мг/л). Полученную смесь78помещали в лунки 96-луночных микропланшет и инкубировали 24 ч при 37ºС в атмосфере воздуха с 5 % СО2. Клетки субкультивировали два раза внеделю после стандартной трипсинизации.2.12.1. Колориметрические тесты оценки жизнеспособности клетокКолориметрические тесты основаны на способности дегидрогеназживых клеток превращать бледно-желтые соли 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) или [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)]-2H-тетразолий(МТS)вокрашенные в темно-синий цвет производные формазана.

Количествообразовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом)характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов вопухолевыхклеткахиможетявлятьсякритериемстепениихчувствительности к противоопухолевым свойствам препарата [180, 181]. Внастоящей работе жизнеспособность клеток оценивали с помощью 3-(4,5диметилтиозол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ). Для этого5.0∙105 клеток MCF-7 в среде погружали в лунки и выдерживали в течение 24часов.

Клетки (70-80% конфлюентных) обрабатывали комплекснымисоединениями в концентрациях 1-60 мкМ, выдерживали в течение 48 ч вкультуральнойсреде.Клетки,используемыевкачествеконтроля,инкубировали с максимальным количеством разбавителя ДМФА (0.1%).После инкубации в течение 48 часов добавляли МТТ-раствор (5 мг/мл) иклетки инкубировали в течение 4 часов.

Концентрацию, при которойпроисходит ингибирование жизнеспособности, определяли путем измеренияоптической плотности , используя тест-фильтр 570 нм. Величина поглощенияпрямо пропорциональна числу живых клеток.Жизнеспособность обработанных клеток выражали в процентахотносительножизнеспособностиклеток,обработанныхконтрольнымсредством. Каждый эксперимент выполняли независимо, повторяя по трираза.792.12.2. Исследование клеточного циклаВ каждую лунку в среду наносили 5.0∙105 клеток MCF-7 на 6-луночныепланшеты. После 24-часовой инкубации клетки обрабатывали эффективнымиконцентрациями, описанными выше. В качестве контроля использоваликлетки, обработанные ДМСО (1%). После 24 ч инкубации клетки дваждыпромывали натрий-фосфатным буфером (pH 7.4), трипсинизировали ицентрифугировали при 360 g в течение 5 мин.

Затем супернатант удаляли иклетки фиксировали в охлажденном этаноле (70% V/V). Чтобы определить вних содержание ДНК, клетки окрашивали пропидий йодидом (PI) ианализировали с использованием проточного цитометра Beckman CoulterCytomicsFC500.Полученныерезультатыбылиобработанысиспользованием программного обеспечения Multicycle AV (Phoenix FlowSystems, США).80Представленные в главе 2 экспериментальные данные иллюстрируютразработанные в рамках диссертационной работы методы синтеза иисследования некоторых тетразолильных производных аминокислот, а такжекомплексов хлоридов платины(II) и палладия(II) с 2R-2Н-тетразол-5-ил- и 5метилтетразол-1-илуксусными кислотами и их производными. Описанные вработе методики являются удобными, безопасными и, как правило,характеризуютсявысокимивыходамипродуктов.Структурасинтезированных комплексов была установлена современными физикохимическими методами исследования.

Характеристики использованногооборудования позволяют говорить о точности и достоверности проведенныхизмерений.Для установлениясоставаистроениясинтезированныхсоединений применялись методы рентгеноструктурного анализа, массспектрометрии,ИК-спектроскопии,элементногоисинхронноготермического анализа. Чистота соединений контролировались методами 1Н и13С ЯМР-спектроскопии и высокоэффективной жидкостной хроматографией.Исследованиебиологическойактивностиinvitroпроводиласьсиспользованием современных биофизических и биохимических методик,совокупностькоторыхпозволяетохарактеризоватьпротивовируснуюактивность тетразолильных аналогов некоторых природных аминокислот, атакже противоопухолевую активностьпроизводных тетразолилуксуныхкислот, координированных с ионами Pt(II), Pd(II).81ГЛАВА 3Синтез тетразолилуксусных кислот и их производных3.1.

Синтез 1Н-тетразол-1-ил- и 2Н-тетразол-5-илуксусных кислоти их производныхЭтиловые эфиры 1- и 2-тетразол-5-илуксусных кислотЭтиловый эфир 1Н-тетразол-5-илуксусной кислоты (1) синтезирован сиспользованием 1,3-диполярного циклоприсоединения из цианоэтилацетата иазида натрия в присутствии триэтиамингидрохлорида в среде ДМФА притемпературе 100-120 °С по известной процедуре (Схема 3.1). [9].Схема 3.1Целевой продукт был очищен от примесей перекристаллизацией изизопропилового спирта.Присутствие тетразолильного фрагмента в структуре исследуемогосоединения подтверждается наличием сигнала гетероцикличекого атомауглерода в спектре ЯМР 13С при δ 153.48 м.д.Этиловые эфиры 2-изо-пропил-2Н- и 2-трет-бутил-2Н-тетразол-5илуксусных кислот (2, 4) были получены селективным алкилированиемэтилового эфира 1Н-тетразол-5-илуксусной кислоты изо-пропиловым итрет-бутиловым спиртами соответственно, в смеси серной и уксуснойкислот при комнатной температуре.

По окончании реакции продуктыэкстрагировали хлороформом из разбавленного водного раствора. Строениесоединений 2, 4 подтверждено методами HRESI+-MS, 1H,спектроскопией. В спектре ЯМР13C{1H}ЯМР-13C наблюдается сигнал четвертичногоэндоциклического атома углерода при 150 - 160 м.д., который надежноподтверждает 2Н-изомерию продуктов реакции 2, 4.82Схема 3.2.Схема 3.3.N-(2-гидроксиэтил)производные получали посредством неселективногоалкилирования NH-незамещенного тетразола галогеналканом.

В результатереакции этилового эфира 1Н-тетразол-5-илуксусной кислоты с бромэтаноломбыла получена смесь, которую впоследствии разделили методом колоночнойхроматографии.Врезультатебылиполученыэтиловыеэфиры2-гидроксиэтил-2Н-тетразол-(7) и 1-гидроксиэтил-1Н-тетразол-5-илуксуснойкислоты (8) (Схема3.3).Этиловый эфир5-метил-1Н-тетразол-1-илуксусной кислотыЭтиловый эфир получали алкилированием триэтиламмониевой соли 5метил-1Н-тетразола (9) этилхлорацетатом в среде ацетонитрила.

Продуктыалкилирования – этиловые эфиры тетразол-1-ил- (10) и тетразол-2илуксусных кислот разделяли с помощью колоночной хроматографии.Эфир 10 очищали методом дробной кристаллизации из водногоэтанола. Этиловый эфир 5-метилтетразол-1-илуксусной кислоты был далееиспользован в синтезе амидов.83Схема 3.4.Схема 3.5.Тетразол-5- и тетразол-1-илуксусные кислотыПроцесс гидролиза эфиров тетразолилуксусных кислот протекает вводной среде полностью в течение часа. Выход продуктов этой реакциипрактическиколичественный.Полученныетакимобразомтетразолилуксусные кислоты представляют собой чистые соединения имогут быть использованы для дальнейших исследований без дополнительнойочистки.

Таким образом была получена 5-метил-1Н-тетразол-1-илуксуснаякислота 11, а также 2-изо-пропил- (3) и 2-трет-бутил-2Н-тетразол-5илуксусные кислоты (6) (cхема 3.7)Схема 3.6.84Схема 3.7.Амиды тетразол-5-ил- и тетразол-1-илуксусных кислотАмиды тетразолилуксусных кислот получали с использованиемреакций соответствующих кислот или их эфиров с аминами (Схема 3.8).Для проведения аминолиза использовали высокоосновные амины:(рКВН+= 11.18.5), аммиак, втор-бутиламин, циклопропиламин.

Процессаминолиза осуществлялся при избыточном содержании амина по отношениюк эфиру тетразолилуксусной кислоты в метанольном растворе.Схема 3.8Схема 3.9.853.2. Синтез аналогов аминокислот, в которых α-NH2-группа замещена на1Н-тетразол-1-ильный фрагмент(2S)-4-(Бензилокси)-4-оксо-2-(1Н-тетразол-1-ил)бутановая кислота (15),(2S)-5-(Бензилокси)-5-оксо-2-(1H-тетразол-1-ил)пентановая кислота (16)1-Замещенные-1Н-тетразолы могут быть получены гетероциклизациейпервичных аминов с азидом натрия и ортоэфирами [91-96].

В литературеимеютсяданныеосинтезететразолильныханалоговприродныхаминокислот, содержащих 1Н-тетразол-1-ильный фрагмент в боковой цепина значительном удалении от асимметрического атома углерода, чтообеспечивало сохранение их оптической чистоты [97 ,98]. Такие соединениябыли использованы в том числе в синтезе пептидомиметиков [98].В работе [99] описан метод получения производных 1R,1H-тетразол-1илуксусной кислоты с использованием реакции -аминогруппы природныхаминокислот. В данной работе, однако, оптическая чистота получаемыхпродуктов реакции не обсуждалась. Учитывая то, что аминогруппа в этомслучаенепосредственносвязанас хиральнымцентром,вопрособэнантиоселективности таких реакций остается открытым.В настоящей работе из соответствующих энантиомерно чистых γбензиловых эфиров L-аспарагиновой и L-глутаминовой аминокислот намисинтезированы соответствующие 2-1Н-тетразол-1-илпропионовые кислоты15, 16 (схема 3.10).

Строение и состав полученных соединений былиустановлены методами 1Н и 13С ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии, атакже с использованием метода хиральной высокоэффективной жидкостнойхроматографии была определена их энантиомерная чистота.86Схема 3.10Тетразолильные аналоги 15, 16 были получены из соответствующих Lаминокислот, азида натрия и триэтилортоформиата в среде ледяной уксуснойкислоты при умеренном нагревании.

Оба соединения были выделены схорошими выходами.Структуратетразоловспектроскопии ЯМР1H и15,1316былаустановленаC. Так, в спектрах ЯМРметодами1Н данныхтетразолильных соединений сигнал атома водорода при эндоциклическомуглероде (С5-Н) проявляется синглетами в области слабого поля при δ 9.19.4м.д. Сигналы эндоциклических атомов углерода в спектре ЯМРС13наблюдаются при δ 144146 м.д.Определенные методом хиральной ВЭЖХ величины энантиомерногоизбытка (ее) для соединений 15, 16 приведены в таблице 3.1.