Диссертация (Свободные и координированные ионами Pt(II), Pd(II) тетразолилуксусные кислоты как перспективные скаффолды в синтезе новых биологически активных веществ), страница 10

Запись УФ-спектров проводиласьпри температуре 21 °С. Исследования выполнены в ресурсном центре«Методы анализа состава вещества» СПбГУ.2.8.2. Исследования методом спектроскопии кругового дихроизмаИсходный раствор тетразолсодержащего комплекса платины(II) илипалладия(II) с концентрацией 10–4 М готовили в 5 мМ NaCl инепосредственно перед измерением и разбавляли до концентрации 10 –5 М.Рабочие растворы с конечной концентрацией комплекса 5—100 мкМ иконцентрацией ДНК 1.515∙10-6 М получали смешиванием растворов ДНК икомплекса. Запись КД-спектров проводилась при температуре 21°С,предварительно выдержав исследуемые растворы 24 ч при 6 °С.Рабочие растворы с значениями r-1 (0.3, 0.7, 1.0, 1.5) для исследованияметодом КД были получены путем смешивания исходного раствора ДНК сисходным раствором комплекса металла.732.8.3.

Исследование термической денатурации ДНКДля оценки взаимодействия синтезированных комплексов металловплатиновой группы с ДНК определяли температуру плавления ассоциатовметодом УФ-спектроскопии. Для этого были приготовлены рабочиерастворы в 5 мМ NaCl, содержащие ДНК и комплекс () с r=1.5.Далеезаписывали спектры УФ-поглощения, постепенно нагревая полученныерабочие растворы в интервале температур 25-90 оС, шаг – 3 оС. После этогобыла построена графическая зависимость максимумов УФ-поглощения оттемпературы.Аналогичнымобразомбылаопределенатемператураплавления нативной ДНК.2.8.4.

Исследование электрофоретической подвижностиРаствор плазмиды ДНК pBR322 (0.0025%) инкубировали в присутствиисоответствующего комплекса металла в течение 16 ч при 37 °С, после чего ккаждому образцу был добавлен загружающий буфер (50% глицерина, 0.25%бромфенолового синего, 0.25% ксиленцианола) и ТАЕ-буфер (0.04 М Трисацетат, 1 мМ ЭДТА, рН 7.4).

Электрофорез этих смесей проводили вагарозном геле (1.0% в TAE-буфере) в течение 3 ч с напряженностьюэлектрического поля 5 В/см. Затем ДНК окрашивали раствором бромидаэтидия в том же буфере. В качестве контроля использовали не обработанныйкомплексомобразецплазмиднойДНКpBR322.визуализировались с помощью трансиллюминатораПолосыДНКVilber Lourmat ификсировались с помощью цифровой камеры.2.8.5.

Исследование вязкостиИспользовался низкоградиентный ротационный вискозиметр маркиZimm-Crothers [44, 45]. Растворы ДНК с комплексами исследовались приградиентах скорости от 1,5 до 3 с-1. Измерялась относительная вязкостьрастворов ДНК ƞr = ƞ / ƞ0 (где ƞ и ƞ0 - вязкость раствора и растворителя,соответственно) при постоянной концентрации ДНК и с различными74концентрациями комплексов. Для анализа была построена зависимостьприведенной вязкости (ƞr – 1) / C раствора ДНК от концентрации комплекса.2.8.6. Исследование взаимодействия комплексов с ДНК методоммолекулярного докингаДля выполнения расчётов по молекулярному докингу комплексов 27 и29 с ДНК использовался программный пакет AutoDock 4.2 вместе с AutoDockMGLTools [48].

В качестве алгоритма поиска и оптимизации использовалсяЛамарковский генетический алгоритм. Для молекулярной стыковки мыиспользовали фрагмент ДНК из Банка данных трёхмерных структур белков инуклеиновых кислот (http://www.rcsb.org/pdb) PDB ID 1BNA [43]. Мыпроводили предварительную обработку, добавляя атомы водорода, а такжеGasteiger к додекамеру ДНК. Координаты комплексов 27 и 29 были взяты изкристаллических структур в виде файла CIF и преобразованы в формат mol2.Все вычисления были выполнены на компьютере под управлением IntelXeon, в качестве операционной системы использовалась Microsoft Windows 7Professional. Для каждого из случаев стыковки в качестве энергии связываниябыла выбрана самая низкая энергия в соответствии с функцией подсчетаAutoDock.2.9.

Взаимодействие комплексов с бычьим сывороточным альбумином2.9.1. Спектральные исследованияЭксперименты с участием бычьего сывороточного альбумина (БСА)проводиливбуферномрастворе50мМNaCl/50мМТрис-(гидроксиметил)аминометан-HCl (Трис-HCl) (pH 7.2) и в оксалатном буфере(рН 1.68), которые были приготовлены с использованием деионизированнойводы.Оксалатныйбуферготовилсяизфиксаналарастворениемвдистиллрованной воде. Растворы БСА и комплексов получали растворяя их вбуферном растворе до требуемых концентраций. Для эксперимента поопределению УФ-поглощения раствор БСА с постоянной концентрацией (c =20.0 μM) титровали растворами комплексов с различной концентрацией (16.075– 40.0 μM). Эксперимент по тушению флуоресценции остатков триптофанаБСА проводился при постоянной концентрации БСА (c = 1.0 μM) различныхконцентрациях комплексов (0.2 – 6.0 μM).

В другом случае, в экспериментепо тушению флуоресценции, в качестве среды использовался оксалатныйбуфер, БСА (c = 1.0 μM)титровали с возрастающими концентрациямикомплекса палладия(II): 0.4 –4.0 μM, Т.о. были получены растворы сразличными молярными соотношениями комплексов к БСА. Спектрыфлуоресценции регистрировались при длине волны возбуждения 279 нм идлиной волны излучения 347 нм. Исследования выполнены на базеРесурсного центра СПбГУ «Методы анализа состава вещества».2.9.2 Исследование взаимодействия комплексов с БСА методоммолекулярного докингаДля выполнения расчётов по молекулярному докингу комплексов 27и 29 с БСА использовался программный пакет AutoDock 4.2 вместе сAutoDock MGLToo 181.0964 ls [48].

Кристаллическая структура BSA (PDBID: 4F5S) [49] была взята из банка из Банка данных трёхмерных структурбелковинуклеиновыхкислот(http://www.rcsb.org/pdb),затемоптимизирована в программе Schrodinger Biologics Suite 2016-3. Рабочийпроцесс и другие параметры расчета и настройки алгоритма были такими же,как и в случае с ДНК.2.10. Изучение противовирусной активности соединений (15, 16)Вирусы и клетки.

В работе был использован вирус гриппаА/California/07/09 (H1N1)pdm09. Вирус пассировали в аллантоиснойполости 10-12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 часов при 36°С.Вкачествеисследуемогоматериалаиспользовалиаллантоиснуюжидкость. При определении титра вируса гриппа использовали культуруклеток MDCK (клетки Мадин-Дарби почек собак, ATCC# CCL-34),выращенных на 96 луночных панелях на среде МЕМ.76Измерение цитотоксичности соединений. Для оценки токсичностив опытах на клеточной культуре MDCK из исследуемых соединенийготовили серию двукратных разведений в концентрации от 500 до 3 мкг/млна поддерживающей среде Игла МЕМ. Разведения препаратов вносили влунки планшетов. Клетки инкубировали в течение 48 часов при 37˚С в CO 2инкубаторе в атмосфере 5% CO2.

Затем проводили микротетразолиевый(МТТ) тест на 96-луночных планшетах. Клетки промывали 2 разафизиологическим раствором (0.9% NaCl) и добавляли по 100 мкл/лункураствора МТТ (3-(4.5-диметилтиазол-2)-2.5 дифенил тетразолий бромид), вконцентрации0.5мкг/млвфизиологическомрастворе.Планшетыинкубировали в течение часа при 37˚С, после чего жидкость удаляли идобавляли в лунки по 0.1 мл диметилсульфоксида. Оптическую плотностьячеек измеряли на спектрофотометре Victor 2 1440 при длине волны 535 нм.На основании полученных данных рассчитывали CTD50, т.е. концентрациюпрепарата, разрушающую 50% клеток в культуре.Титрование вируса. Из исходного вирусосодержащего материалаготовили серию десятикратных разведений (10-1 – 10-6).

В лунки планшетов,содержащие монослой клеток MDCK, вносили исследуемые препараты внеобходимых концентрациях (3-300 мкг/мл) и инкубировали в течение 1часа. После этого в лунки вносили вирус и инкубировали планшеты втечение 48 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2. По истечении этого срокакультуральнуюжидкостьпереносиливлункипланшетадляиммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1%куриных эритроцитов в физиологическом растворе.Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакциигемагглютинации (РГА) эритроцитов.

За титр вируса принимали величину,противоположнуюдесятичномулогарифмунаибольшегоразведениявируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации ивыражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозывируса (lg ЭИД50). О противовирусной активности соединений судили по77снижению титра вируса по сравнению с контролем.