Диссертация (Свободные и координированные ионами Pt(II), Pd(II) тетразолилуксусные кислоты как перспективные скаффолды в синтезе новых биологически активных веществ), страница 15

Однако гидродинамические измерения позволяютполучить более конкретную информацию, необходимую для определениямеханизма взаимодействия комплекса с нуклеиновой кислотой [129].Вязкость растворов ДНК зависит от изменений её длины, котораяможет изменяться в результате ее взаимодействия с комплексом металла.Так, интеркалирующий металлический комплекс вызывает разделение пароснований, что приводит к удлинению спирали нуклеиновой кислоты иувеличению ее вязкости. В случае частичной и/или неклассическойинтеркаляции (бороздочное связывание, взаимодействие комплекса ссахарофосфатным остовом) наблюдается изгибание двойной спирали ДНК,приводящее к менее заметным изменениям (увеличению или уменьшению)вязкости, либо вообще не вызывая изменений в вязкости раствора ДНК [130].В настоящем исследовании, влияние тетразолсодержащих транскомплексов на гидродинамические свойства ДНК рассмотрено на примерекомплекса 28 (транс-[PdCl2L2], L = этиловый эфир-2-трет-бутил-2Нтетразол-5-илуксусной кислоты).Полученные данные свидетельствуют отом, что добавление комплекса к раствору ДНК тимуса телёнка вызываетуменьшениевязкостираствора.Связываниеможетсопровождатьсяперегибами двойной спирали ДНК, которые вызывают уменьшение еёразмера[131].Следуетотметить,чтоэкспериментальныекривые,полученные как сразу после смешивания (через 20 мин) раствора ДНК сраствором комплекса, так и после суточного хранения растворов при 4°С,имеютсхожийпредварительнохарактер.Полученныеобсуждаемуюгипотезурезультатыовозможномподтверждаютбороздочномсвязывании комплексов металлов с ДНК тимуса телёнка [132]1151.0red/red(DNA)0.80.60.4120.20.00.000.050.100.150.200.25Ccomplexx104, MРисунок 3.14.

Зависимость вязкости ДНК-растворов от концентрации комплекса 28 (trans[PdCl2L2], L = этиловый эфир-2-трет-бутил-2Н-тетразол-5-илуксусной кислоты) в 5 мМNaCl. [ДНК] = 0,0066% (66 мкг/мл): 1 - после смешивания (20 мин); 2 – спустя сутки послехранения смеси при 4 °C.1163.5.1.5.

Исследование методом гель-электрофорезаИзвестно,чтометод,основанныйнаисследованииэлектрофоретической подвижности ДНК чрезвычайно информативен длямониторинга изменений, происходящих в третичной структуре ДНК[133,134]. Исследование электрофоретической подвижности проводили сиспользованием плазмидной суперспирализованной ДНК бактерий. Нативнаяплазмидная ДНК находится в обычном состоянии в суперспирализованнойформе,такжеизвестнойкакковалентно-закрытаякольцеваяДНК,обозначенная здесь как форма I. Одноцепочечные разрывы приводят кобразованию, так называемой, открытой кольцевой ДНК (обозначенной какформа II), в то время как двухцепочечное расщепление приводит кобразованию линейной ДНК (обозначенной как форма III). Скоростьмиграции ДНК в агарозном геле зависит как от длины полинуклеотида(количества пар оснований), так и от конформации, причем более коротокаяи/или конденсированная ДНК мигрирует быстрее, чем более длинная и/илираскрученная ДНК.

Суперспирализованная ДНК (форма I) имеет плотноупакованную конформацию и, следовательно, быстрее переносится черезагарозный гель, чем линейная ДНК (имеет промежуточную скоростьмиграции) или открытая кольцевая ДНК (имеет самую низкую скоростьмиграции) [121].В настоящей работе исследовали способность комплексов 27, 28, 30,31,33связыватьираскручиватьДНКпослепревращениясуперспирализованной формы плазмидной ДНК pBR322 в открытуюкольцевую форму с использованием электрофореза в агарозном геле (рис.3.15,3.16).Результатыгель-электрофорезасуперспирализованнойплазмидной ДНК pBR322 в присутствии 0,1-0,4 мМ комплексов говорят отом, что при рН 7.2 все соединения взаимодействуют с ДНК (Рис. 3.15).Электрофореграммадемонстрируетэлектрофоретическойподвижности.концентрационнуюзависимостьКромеувеличениемтого,с117концентрациикомплексовPd(II)31,33наблюдаетсявозможноепревращение суперспирализованной ДНК (форма I) в открытую кольцевуюДНК (форма II).

Образования линейной ДНК (форма III), не наблюдается нидля одного из комплексов.Рисунок 3.15. Электрофореграмма плазмидной ДНК pBR322 (300 нг) в агарозном геле,после обработки комплексами 33 и 28 (0,1-0,4 мМ) и 16 ч инкубации (в зависимости отконцентрации) Дорожка 1: контроль; дорожка 2: 0,1 мМ компл. 33 + ДНК; Дорожка 3: 0,2мМ компл.33 + ДНК; Дорожка 4: 0,4 мМ 33 + ДНК. Дорожка 5: 0,1 мМ 28 + ДНК;Дорожка 6: 0,2 мМ 28 + ДНК; дорожка 7: 0,4 мМ 28 + ДНК, дорожка 8: маркер в трисбуфере (5 мМ Трис-HCl / 50 мМ NaCl, pH 7,2 при 25 °С).Заметное количество формы II образуется в случае комплексов 33, 28,27 при концентрации 0,4 мМ. Малое влияние на ДНК оказывают соединения30и31,содержащиевкачествелигандаэтиловыйэфир2-гидроксиэтилтетразол-5-илуксусной кислоты (рис.

3.16).Рисунок 3.16. Электрофореграмма плазмидной ДНК pBR322 (300 нг) в агарозном геле,после обработки комплексами 27, 30 и 31 (0,1-0,4 мМ) и 16 ч инкубации (в зависимостиот концентрации): дорожка 1: 0,1 мМ компл.27 + ДНК; дорожка 2: 0,4 мМ компл. 27 +ДНК; дорожка 3: 0,1 мМ компл. 30 + ДНК; дорожка 4: 0,4 мМ компл. 30 + ДНК. дорожка5: 0,1 мМ компл. 31 + ДНК; дорожка 6: 0,4 мМ компл. 31 + ДНК, дорожка 7: контроль,дорожка 8: маркер в трис-буфере (5 мМ Трис-HCl / 50 мМ NaCl, pH 7,2 при 25 ° С).1183.5.1.6. Молекулярный докинг комплексов Pd(II) и Pt(II)с додекамером ДНК d(CGCGAATTCGCG)2Для выяснения способа взаимодействия и аффинности связываниякомплексов с ДНК была проведена молекулярная стыковка додекамераd(CGCGAATTCGCG)2 {PDB ID: 1BNA} с комплексами Pd(II) и Pt(II) 28 и 29,содержащие этиловый эфир 2-трет-бутил-тетразол-5-илуксусной кислоты вкачестве лиганда.

Исследование показало, что данные комплексы металловэффективно взаимодействуют с ДНК, связываясь с ее малой бороздой (рис.3.17). При этом металлокомплексы принимают конформацию оптимальнуюдля образования vdW контактов с фрагментом GAAT 1BNA. Следуетотметить, что ось Cl-M-Cl ориентирована перпендикулярно ДНК (рис.3.18А). Для комплексов Pd(II) или Pt(II), наблюдается один и тот же способразмещения комплексов (рис. 3.18Б). Важно отметить, что кластеризацияпоказывает, что три наиболее энергетически предпочтительные кластерырасположены именно в области малой борозды (рис. 3.18В).AБРисунок 3.17.

Молекулярная модель докинга металлических комплексов 28 (модель A)и 29 (модель Б) с ДНК (PDB ID: 1BNA).119АБВГРисунок 3.18.Докиинг комплексов 28 и 29 с молекулой ДНК в различных проекциях120аКомплексСвободная энергиясвязванияa (ΔGbinding)Vdw_hb_desolvenergy(ΔGvdW +hb + desolv)Электростатическаяэнергия(ΔGelec)Общая внутренняяэнергия(ΔGtotal)Свободнаяторсионная энергия(ΔGtor)Энергия несвязанной системы(ΔGunb)Предполагаемаяконстантаингибированияb, Ki,μMТаблица 3.6Результаты докинга комплексов 28 и 29 с додекамером B-ДНК d(CGCGAATTCGCG)2{PDB ID: 1BNA}, ккал моль-127-5.56-8.75-0.10-2.06+3.29-2.0684.1928-6.12-9.39-0.02-0.97+3.29-0.9732.73ΔGbinding = ΔGvdW + hb + desolv + ΔGelec + ΔGtotal + ΔGtor- ΔGunbТемпература 298.15 KbКомплекс Pt (II) 29 демонстрирует более высокую энергию связыванияс ДНК 1BNA (наименьшая свободная энергия связи ΔGсвязывания = -6,12 ккал.моль-1) по сравнению с комплексом Pd (II) 28 (самая низкая свободнаяэнергия связи ΔGсвязывания = -5,56 ккал моль-1).Таким образом, расчеты методом молекулярной механики хорошокоррелируются со спектральными данными и подтверждают именномеханизм бороздочного связывания.1213.5.2.

Исследование взаимодействия между БСА и комплексамиметаллов с производными тетразолилуксусных кислотПриродаисилавзаимодействияальбуминаслекарственнымпрепаратом влияет на абсорбцию, распределение, метаболизм и выведениепрепарата из организма. Кроме того, взаимодействие лекарственногосредства с белками плазмы непосредственно влияет на концентрациюлекарства в крови и его биологический эффект.

Одним из самых важныхпреимуществ альбуминов в том, что они обратимо связываются сразличнымисоединениями.Белокчастоувеличиваетрастворимостьгидрофобных лекарственных средств в плазме и влияет на кровообращение,обмен веществ и эффективность препаратов [135]. Как правило, слабоесвязывание препарата с белками говорит о его плохом распределении ибыстром выведении из организма, в то время как сильное связываниеприводит к уменьшению концентрации активной формы лекарственногосредства. [136]Таким образом, исследование механизма взаимодействия малыхмолекул с сывороточным альбумином имеет важное значение для пониманияфармакодинамики и фармакокинетики лекарственных препаратов.

[137,138].Сывороточные альбумины являются наиболее распространеннымибелками в системе кровообращения, которые играют важную роль втранспорте иосажденииразличныхэкзогенныхсоединений.Средисывороточных альбуминов бычий сывороточный альбумин (БСА) являетсяподходящейбелковоймодельюдляизучениявзаимодействияслекарственными средствами из-за его лигандсвязывающих свойств иструктурной гомологией с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА)[125].В рамках данного исследования с помощью УФ-спектроскопиипоглощения и флуориметрии экспериментов тушения триптофана изученаспособность металлокомплексов 28, 34, 38 связываться с БСА. Наиболее122благоприятные сайты связывания были определены теоретически с помощьюмолекулярного докинга.3.5.2.1. Исследование взаимодействия металлокомплексов с БСАметодом УФ-спектроскопииОдним из распространенных методов, используемых для определениямеханизмасвязыванияБСАскомплексомметалла,являетсяУФ-спектроскопия.