Диссертация (Свободные и координированные ионами Pt(II), Pd(II) тетразолилуксусные кислоты как перспективные скаффолды в синтезе новых биологически активных веществ), страница 14

Аналогичные105спектральные данные были получены для всех исследованных соединений33-37. В дальнейшем они были использованы для расчета величин константсвязывания Кbin комплексов с ДНК ТТ. Изменения в характере спектральногопоглощения растворов смесей ДНК ТТ и комплексов при различныхконцентрациях ДНК ТТ и комплекса наиболее четко можно обнаружить прианализе рассчитанных и нормализованных спектров (Рисунок 3.8), в которыхпроявляетсязаметныйбатохромныйсдвиг.Согласноизвестнымлитературным данным, такой сдвиг свидетельствует о наличии ассоциацииисследуемых металлокомплексов с биополимером. Количественно даннаяассоциация может быть оценена с помощью констант связывания (Kbin)[82].r 0.3r 0.5r 0.7r 1.0r 2.0r 3.0r 4.0r 6.00.400.35А0.300.250.200.150.100.05240260280300320Длина волны, нмРисунок 3.7.

УФ спектры ДНК ТТ при различных концентрациях (1.36, 2.27, 3.20, 4.55,6.82, 9.10, 18.2, 27.3 μM) в присутствии комплекса 34 (4.55 μM) в буферном растворе (50мM NaCl/50 мM трис-(гидроксиметил)аминометан – HCl; pH 7.2) при стехиометрическихсоотношениях r = [ДНК]/[комплекс] = 0, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2, 3, 4 и 6.106r0r1r2r4r61.0Анорм0.80.60.40.20.0240260280300Длина волны, нмРисунок 3.8. Рассчитанные и нормированные спектры поглощения ДНК ТТ привзаимодействии с комплексом 34.В ряде публикаций были описаны подходы к расчету величины Kbin[112,115]. Пользуясь данными подходами, на основании полученныхспектральных данных, были рассчитаны величины Kbin для комплексовметаллов 33-37, 24-29 в соответствии с уравнением:,где Kbin – константа связывания; [ДНК] – концентрация ДНК, εa, εf и εb –коэффициенты наблюдаемой молярной экстинкции (Aнабл/[M]), коэффициентмолярной экстинкции несвязанного комплекса металла (M) и коэффициентмолярной экстинкции комплекса металла (M), полностью связанного с ДНК,соответственно.

Как показано на Рисунке 3.9, зависимость [ДНК]/(εa-εf) от[ДНК] линейна для комплексов 24-37 с высоким коэффициентом линейнойрегрессии.107Рисунок 3.9. Зависимости [ДНК]/(εa-εf) от [ДНК] для комплексов: 1 – комплекс 24, 2 –комплекс 25, 3 – комплекс 26, 4 – комплекс 27, 5 – комплекс 29, 6 – комплекс 31, 7 –комплекс 35, 8 – комплекс 37.Значения величин констант связывания и изменения свободной энергииассоциации металлокомплексов с ДНК (ΔGbin = -RTlnKbin) приведены втаблице 3.3.Таблица 3.3. Величины констант связывания (Kbin) и изменения свободной энергииассоциации комплексов 1-9 с ДНК ТТ (ΔGbin).СоединениеKbin (M-1)ΔGbin (кДжмоль-1)241.33×106-34.9254.64×105-32.3265.68×105-32.8275.02×105-32.5284.80×105-32.4108295.93×105-33.6318.82×105-33.935373.67×1057.82×105-31.7-32.9Рассчитанные величины Kbin для тетразолсодержащих комплексовплатины(II) и палладия(II) свидетельствуют о сильном взаимодействии сДНК ТТ.

При этом, комплексы платины(II) 29, 31 и 37 проявляют несколькоболее высокую аффинность к ДНК при связывании, чем соответствующиекомплексы палладия(II) 24-28, 35. Это согласуется с данными, полученнымиранее для координационных соединений платины(II) и палладия(II) сдругими гетероциклическими лигандами.Величины констант связывания Kbin, а также ΔGbin указывают навозможностьсамопроизвольногообразованияустойчивыхассоциатовметаллокомплексов 24-29, 31, 35, 37 с ДНК [119].Учитывая вышесказанное,рассматриватьсякаккомплексыпотенциальные24-29, 31, 35,цитостатики,37могутдействующиепомеханизму связывания с молекулой ДНК.1093.5.1.2. Исследование методом спектроскопии кругового дихроизмаМетодкруговогочувствительныхметодовдихроизмаявляетсяисследованияоднимизконформационныхнаиболееизменений,обусловленных взаимодействием малых молекул с ДНК [117].

Спектркругового дихроизма раствора ДНК состоит из положительной полосы при275нм,обусловленнойстекинг-взаимодействиемнуклеотидов,иотрицательной полосы при 246 нм, связанной с хиральностью правойспирали В-формы ДНК. Метод спектроскопии кругового дихроизма можетиспользоваться для определения типа взаимодействия комплексов металлов сДНК [118-120]Спектры КД были записаны при постоянной концентрации ДНКтимуса телёнка (3,0 μM) и различных молярных соотношениях комплексовметаллов.

В качестве модельных соединений для этого исследования быливыбраныдвааналогичныхкомплекса28и29,отличающихсяметаллическими центрами (Pt, Pd). Значения r (r = [metal complex]/[DNA])варьировались от 0.3 до 1.0.Спектры КД ДНК тимуса телёнка в присутствии комплексов 28 и 29демонстрируют сходные изменения в положительной области спектра инесколько отличающиеся изменения в отрицательной области. В случаекомплекса Pd (II) 27 постепенное добавление комплекса к ДНК приводит куменьшению его интенсивности поглощения как в положительной, так и вотрицательной областях спектра. Такие изменения могут быть обусловленысвязыванием с ДНК исследуемых металлокомплексов по механизмубороздочного связывания [118,121].КД-спектры ДНК тимуса телёнка в отрицательной области спектра вприсутствии различных концентраций соединений 28 и 29 демонстрируютизменения соответствующие изменениям В-конформации ДНК (рис.

3.10).110-32Elipticity 101DNAz 0.3z 0.7z 1.0z 1.50-1240260280300Wavelength (nm)Рисунок 3.10. КД-спектр ДНК тимуса телёнка в присутствии различных количествкомплекса 28 при следующих стехиометрических соотношениях: r = [комплекс металла] /[ДНК] = 0.0, 0.3, 0.7, 1.0 в 5 мМ NaCl.В положительной области спектров кругового дихроизма ДНК тимусателенканаблюдаетсязаметноеуменьшениеинтенсивностикакдлясоединения 27, так и для комплекса 28 (рис.

3.10, 3.11). Это может указыватьна то, что изученные соединения нарушают взаимодействие междунуклеотидами в дуплексе ДНК [121].Elipticity 10-321DNAr 0.3r 0.75r 1.0r 1.50-1240260280300Wavelength (nm)Рисунок 3.11. КД-спектр ДНК CT в присутствии различных количеств комплекса 29 приследующих стехиометрических соотношениях: r-1 = [комплекс металла] / [ДНК] = 0, 0,3,0,75, 1 и 1,5 в 5 мМ NaCl.111Отметим, что лиганд – этиловый эфир 2-трет-бутил-тетразол-5илуксусной кислоты – не вызывает изменений в спектре КД в тех жеусловиях (рис. 3.12).

Таким образом, свободный лиганд не индуцируетмодификаций во вторичной структуре ДНК.r 0.3r 0.75r 1.0DNAElipticity 10-33210-1-2240260280300Wavelength (nm)Рисунок 3.12. – КД-спектр ДНК ТТ в присутствии различного количества этилового эфира2-трет-бутил-тетразол-5-илуксусной кислоты при следующих стехиметрическихсоотношениях:-1R = [этил-2-трет-бутил-тетразол-5-илацетат] / [ДНК] = 0.0, 0.3, 0.7, 1.0 в 5 мМ NaCl.3.5.1.3. Термическая денатурация ДНКПовышение температуры оказывает сильное влияние на изменениестабильности двухцепочечной структуры ДНК, вызывая образованиеоднонитевой структуры, так называемое «плавление» нуклеиновой кислоты.При этом происходит полная термическая денатурация из-за нарушенияводородныхсвязеймеждупарамиоснований,присутствующихвдвухцепочечной ДНК, значительно уменьшается вязкость и возрастаетинтенсивность поглощения в УФ-области [122,123].Температура,прикоторой50%дуплекснойДНКостаётсявдвухцепочечном состоянии, считается температурой плавления ДНК (Tm)[124].

Tm ДНК напрямую зависит от стабильности ее двойной спирали.Взаимодействие ДНК с малыми молекулами может стабилизировать112структуру нуклеиновой кислоты, вызывая конформационные изменения, чтообычно приводит к увеличению значения Tm [125]. Изменение температурыплавления ДНК в присутствии комплексов металлов, по сравнению снативной ДНК, можетдать представление об относительнойсилевзаимодействия между биополимером и металлокомплексом [126,127].Для определения силы взаимодействия ДНК с комплексами платины ипалладия, содержащих в качестве лигандов тетразолилуксусные кислоты иих производные, определяли температуру плавления раствора нативной ДНКтимуса телёнка и раствора ДНК после смешения с растворами комплексов28, 29, 30, 32, 33, 36, 37 и 39.

Кривые плавления ДНК тимуса телёнка (3.0мкМ, 1.0 мкМ) в присутствии комплексов Pd(II) 28, 30, 32, 33, 36 и 39 и Pt(II)29 и 37 с стехиометрическим соотношением r = 1,5 (r =[комплекс металла] /[ДНК]) представлены на Рисунке 3.13. Значение Tm нативной ДНК тимусателёнка составило 62 °С, однако при добавлении комплексов металлов этозначение резко увеличивалось до 70-80 °С. Во всех случаях добавлениекомплексов к раствору ДНК вызывает увеличение температуры денатурацииΔTm ≥ 7 °C (таблица 3.5).

Данный факт свидетельствует о сильнойстабилизации двойной спирали, обусловленной взаимодействием данныхкомплексов металлов с ДНК. [125,128].113DNAcomplex 28+DNAcomplex 36+DNA0,32Absorbance0,300,280,260,240,220,2030405060708090oTemperature ( C)Рисунок 3.13. Кривые плавления CT-ДНК (1,0 мкМ) в отсутствие и в присутствиикомплексов 28 и 36 в 5 мМ NaCl в стехиометрическом отношении:r = [комплекс металла] / [ДНК] = 1,5.Таблица 3.5. ΔTm значения CT-ДНК в присутствии комплексов 28, 29, 30, 32, 33, 34,37 и 39 в 5 мМ NaCl при стехиометрическом отношении: r = [комплекс металла] / [ДНК]= 1,5.Комплекс2829303233343739ΔTm, ◦C81410131510881143.5.1.4. Исследование методом вискозиметрииСпектроскопическиеисследованияпозволяютполучитьважныесведения, которые помогают предполагать тип и прочность взаимодействиякомплекса металла с ДНК.