Диссертация (Свободные и координированные ионами Pt(II), Pd(II) тетразолилуксусные кислоты как перспективные скаффолды в синтезе новых биологически активных веществ), страница 16

УФ-спектры БСА регистрируются в присутствии различныхконцентраций комплекса металла.Абсорбционный спектр БСА имеет две характеристичные полосы.Сильная полоса поглощения в диапазоне 220-240 нм обусловлена наличиемα-спирали в структуре альбумина, а поглощение в области 280 нм – наличиемароматическихаминокислотныхостатков(Trp,TyrиPhe).[139].Спектральный сдвиг полос поглощения БСА очень чувствителен кокружающемумикроокружениюиизменениямконформациибелка.Уменьшение оптической плотности при 220 нм свидетельствует обискажении вторичной структуры белка.

[139]. Напротив, изменения,наблюдаемые в области 280 нм, указывают на то, что происходят изменениявмикросредевнепосредственнойблизостиотароматическихаминокислотных остатков [140].Для исследования механизма и силы связывания тетразолсодержащегокомплекса с альбумином в качестве модельных соединений были выбраныкомплексы 28, 33, 34. Проанализированы спектры УФ-поглощения растворовБСАвприсутствиирастворовметаллокомплексовсразличнымиконцентрациями. Спектры БСА в присутствии комплекса 33 (комплексметалла с 5-метил-тетразол-1-илуксусной кислотой в качестве лиганда)сильно отличается от УФ-спектров комплексов 28, 34 (этиловый эфир 2трет-бутил-тетразол-1-илуксусной кислоты и этиловый эфир 5-метилтетразол-1-илуксусной кислоты и соответственно в качестве лигандов). Вслучае комплекса кислоты 33 интенсивность поглощения при 226 нм с123увеличением концентрации возрастает незначительно, и практически ненаблюдается изменений в области 278 нм (Рисунок 3.19).

Это можетуказывать на то, что, в целом, комплекс 33 несколько влияет на αспиральную структуру белка, но практически не изменяет микросреду вобласти ароматических аминокислот БСА. С другой стороны, придобавлении комплексов эфиров 28, 34 к раствору альбумина интенсивностьполос поглощения при 226 и 278 нм заметно уменьшается (рис.

3.20, 3.21).Данный факт указывает на то, что специфическое взаимодействиекомплексов с БСА может вызывать конформационные изменения в структуреα-спирали и изменять полярность микросреды в области остатков тирозина итриптофана [141].3,50.500.45Absorbance3,0Absorbance2,50.400.350.300.250.202,00.15260270280290300Wavelength (nm)1,51,00,50,0200220240260280300320Wavelength (nm)Рисунок 3.19. Спектры УФ-поглощения БСА (c = 60,0 мкМ) в присутствии различнойконцентрации комплекса 33 (от 49,0 до 120,0 мкМ) в трис-буфере (50 мМ NaCl / 50 мМТрис- (гидроксиметил) аминометан-HCl , рH 7,2).1241,00,8A0,60,40,20,0200220240260280300Длина волны (нм)Рисунок 3.20. Спектры поглощения БСА (c = 60,0 мкМ) в присутствии комплекса 28 сразличными концентрациями (от 49,0 до 120,0 мкМ) в трис-буфере (50 мМ NaCl / 50 мМТрис- (гидроксиметил) аминометан - HCl, pH 7,2).0,4Absorbance3.0Absorbance2.50,30,20,12.00,02601.5270280290Wavelength (nm)1.00.50.0200220240260280300320Wavelength (nm)Рисунок 3.21.

Спектры УФ-поглощения БСА (c = 60,0 мкМ) в присутствии различнойконцентрации комплекса 34 (от 49.0 до 120.0 мкМ) в трис-буфере (50 мМ NaCl / 50 мМТрис- (гидроксиметил) аминометан-HCl , рH 7,2).1253.5.2.2 Метод флуоресцентной спектроскопииОдним из эффективных подходов для оценки взаимодействия междукомплексами металлов и БСА является использование флуоресцентнойспектроскопии. БСА является эффективным люминофором, при этомфлуоресцируют три аминокислотных остатка, присутствующие в структуреальбумина: триптофан, тирозин и фенилаланин [142]. Однако посколькуотносительноеотношениеинтенсивностифлуоресценциидляэтихаминокислот составляет 100 : 9 : 0,5 соответственно, то очевидно, чтофлуоресценция БСА обусловлена в основном двумя остатками триптофана:Trp-134, который расположен на поверхности поддомена IB, и Trp-213,расположеного в гидрофобной части кармана в субдомене IIA [143].Спектрыфлуоресценциирегистрировалисьвотсутствиеивприсутствии различных концентраций комплексов 33, 34, 35 и 28.Спектры флуоресценции БСА значительно меняются в присутствиикомплексов металлов, содержащих сложные эфиры тетразолилуксусныхкислот 28, 34, 35 в качестве лигандов.

Из данных, представленных нарисунках 3.22, 3.24, 3.26, видно, что с увеличением концентрациикомплексов 28, 34 35 интенсивность флуоресценции раствора BSA в области345 нм уменьшается. Это может указывать на то, что взаимодействиекомплексов 28, 34, 35 с БСА приводит к конформационным изменениямструктуры белка, что приводит к изменениям микросреды в областитриптофана [141].126Fluorescence Intensity806040200300350400Wavelength (nm)Рисунок 3.22. Эмиссионные спектры БСА (c = 1,0 мкМ) в присутствии различнойконцентрации комплекса 28 (от 0,2 до 6,0 мкМ) в трис-буфере (50 мМ NaCl / 50 мМ Трис(гидроксиметил) аминометан-HCl; pН 7,2).Рисунок 3.23. ГрафикШтерна-Фольмера (зависимость I0/I от [M]) для определения значенийKSV для комплекса 28.127Fluorescence Intensity806040200300350400Wavelength (nm)Рисунок 3.24. Эмиссионные спектры БСА (c = 1,0 мкМ) в присутствии различныхконцентраций комплекса 34 в трис-буфере (50 мМ NaCl / 50 мМ трис-(гидроксиметил)аминометан - HCl, pH 7.2).Рисунок 3.25.

График Штерна-Фольмера (зависимость I0/I от [M]) для определениязначений KSV для комплекса 34.128Fluorescence Intensity100806040200300350400Wavelength (nm)Рисунок 3.26. Эмиссионные спектры БСА (c = 1,0 мкМ) в присутствии различныхконцентраций комплекса 35 (от 0.2 до 6.0 мкМ) в трис-буфере (50 мМ NaCl / 50 мМ Трис(гидроксиметил) аминометан-HCl, pH 7,2)Рисунок 3.27.

График Штерна-Вольмера (зависимость I0/I от [M]) для определениязначений KSV для комплекса 35.Отметим, что добавление комплекса иона Pd(II) 33, содержащего вкачестве лиганда свободную 5-метил-тетразол-1-илуксусную кислоту, краствору BSA не приводит к заметным изменениям в интенсивностифлуоресценции при рН 7.2 (рисунок 3.28). Это может быть обусловленодиссоциацией карбоксильных остатков тетразол-1-илуксусной кислоты с129образованием соответствующих карбоксилат-анионов, которые не способнысвязыватьсясБСА.Этагипотезаподтверждаетсяизменениямифлуоресценции БСА в присутствии комплекса 33 при низких значениях рН(1.6), где что остатки карбоновой кислоты недиссоциированы (рис.15).Спектральное поведение раствора BSA с комплексом 33 при рН 1.6, а также34 и 27 при pН 7.2 аналогично.Fluorescence Intensity806040200300350400450Wavelength (nm)Рисунок 3.28.

Эмиссионные спектры БСА (c = 1,0 мкМ) в присутствии различныхконцентраций комплекса 33 (от 0.2 до 6.0 мкМ) в трис-буфере (50 мМ NaCl/50 мМ Трис(гидроксиметил)аминометан - HCl, pH 7.2).130Fluorescence Intensity10080604020300320340360380400Wavelength (nm)Рисунок 3.29.

Эмиссионные спектры БСА (c = 1,0 мкМ) в присутствии различныхконцентраций комплекса 33 (от 0,4 до 4,0 мкМ) в оксалатном буфере при рН 1,6.Тушение флуоресценции БСА в присутствии комплексов 28, 34, 37было проанализировано с использованием уравнения Штерна-Фольмера[125]:,где I0 и I – интенсивности флуоресценции БСА в отсутствие и в присутствиитушителя (т.е. комплекса металла), соответственно, KSV - константа тушенияШтерна-Фолмера, [M] – концентрация тушителя.

Линейная зависимость I0/Iпо отношению к [М] указывает на то, что реализуется один тип механизматушения [125,144]. Значения KSV для соединений 27, 34, 35 составляютсоответственно 7.22×105, 1.95×106 и 9.04×104 М-1 с-1.ЭффективностьвзаимодействиямеждуBSAисоединениемописывается константой связывания (Kbin). Значения Kbin в диапазоне 104-106M-1 свидетельствует об эффективном связывании с белком [145]. В данномдиапазоне связывание достаточно высоко, чтобы значительное количествокомплексатранспортировалосьираспределялосьпоорганизму,но131достаточно низко, чтобы соединение высвободилось, как только онодостигнет своей цели (ДНК).Значения Kbin вычислялись по уравнению Скатчарда [125]:,где I0 и I - интенсивности флуоресценции белка в отсутствие и в присутствиикомплекса металла соответственно, [M] – концентрация комплекса металла,Kbin – константа связывания, а n представляет собой число сайтовсвязывания.Примерграфикавлогарифмическом масштабеlog[I0-I/I]поотношению log [M] для комплекса 28 показан на рисунке 3.30.Рисунок 3.30.

Графическая зависимость log [(I0-I)/I] от log [M] ассоциата БСА-комплекс 28для определения константы Kbin.Значение n около 1 указывает на наличие одного сайта связывания дляассоциированного БСА с соединениями 34 и 27 [125]. Значения Kbin,полученные из графика log [(I0-I)/I] относительно log [M], составляют4.12×105 л * M-1 для комплекса 34; 1,61×105 л * M-1 для комплекса 37 .и 8.32 ×104 л*M-1 для комплекса 28. Таким образом, взаимодействие альбумина скомплексами Pd(II) аналогично в случае соединений 34 и 38, в то время какдля комплекса 28 оно несколько слабее.1323.5.2.3. Определение места связывания тетразолсодержащих комплексовметаллов с БСА методом молекулярного докингаВзаимодействие малых молекул с альбумином расположены вгидрофобных полостях в субдоменах IIA и IIIA участков I и IIсоответственно [125].