Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 7

Локализация белка POT1 на теломерах зависит от его взаимодействия с TPP1 (а вконечном счёте от TRF1 и TRF2), но не зависит от его способности связывать ДНК [142, 147].Количество всех компонентов шелтеринового комплекса на теломерах увеличивается с длинойтеломер [142]. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что шелтерин выполняет своюфункцию как единое целое, несмотря на существование специфических функций для каждогоиз белков. Наглядно это было продемонстрировано, по крайней мере, на мышиных клетках:результатом совместного нокаута mTRF1 и mTRF2 явилось полное освобождение теломер откомпонентов шелтерина [151].

Этот факт несколько отличает шелтерин человека от подобногокомплекса в делящихся дрожжах, который представляет собой более динамичную структуру.Удаление ДНК-связывающего домена POT1 приводит к удлинению теломер (но не кдиссоциации POT1 или других компонентов шелтерина), следовательно, связывание ДНКбелком POT1 может являться ключевым событием в регуляции теломеразы. При этом POT1выступает в качестве последнего посредника в передаче сигнала о длине теломеры [142]. Одиниз возможных вариантов нарушения работы теломеразы посредством связывания ДНК белкомPOT1 – конкуренция POT1 и теломеразы за связывание 3'-конца теломеры. Возможностьингибирования по такому механизму была продемонстрирована, по крайней мере, in vitro.Таким образом, комплекс теломерных белков человека выполняет роль сенсора длинытеломер и контроль длины теломер человека может осуществляться по принципу "счётабелков", как и в описанных выше дрожжевых системах (Рисунок 2.16).34Рисунок 2.16.

Модель регуляции длины теломер человека шелтериновым комплексом[132].Однако, POT1 также оказывает положительное влияние на теломеры. СуперэкспрессияPOT1 приводит к удлинению теломер [152]. Вдобавок, in vitro POT1 блокирует теломеразнуюактивность только на некоторых субстратах. При связывании POT1 с олигонуклеотидом так,что хотя бы восемь нуклеотидов с 3’-конца остаются свободными, активность и процессивностьтеломеразы даже увеличиваются [153]. Более того, дальнейшее увеличение активности в этомслучае происходит при дополнительном добавлении белка TPP1 [154]. Эти результаты говорято возможности более сложного влияния шелтеринового комплекса на работу теломеразы invivo.Предполагаютналичиедополнительногофактораи/илипосттрансляционноймодификации, которые могли бы переключать POT1/TPP1 из ингибирующего состояния вактивирующее [154].Ключевым моментом в предложенной модели регуляции теломеразы человека белкамишелтеринового комплекса является контроль активности (процессивности) теломеразы.Однако, в рассмотренных ранее аналогичных моделях дрожжей ингибирующее действиетеломерных белков было скорее направлено на привлечение теломеразы на теломеры.

Какимже образом происходит доставка теломеразного комплекса на теломеры человека?Оказывается, взаимодействие между N-концевым OB-fold доменом TPP1 и N-концевымдоменом hTERT, необходимое для активации теломеразы, также важно для взаимодействиятеломеразы с теломерами [155, 156]. Удаление N-концевого домена TPP1 приводит кукорочению теломер, в отличие от фенотипа нокдауна полноразмерного TPP1. Этот фактдобавляетсложностивмеханизмконтролятеломеразышелтерином.Болеетого,35фосфорилирование TPP1 по остатку Ser111, происходящее в поздней S, G2 и M фазахклеточного цикла, отвечает за регуляцию привлечения теломеразы по клеточному циклу [157].Другим важным аспектом ассоциации теломеразы с теломерами является локализация втельца Кахаля (ТК) – особые клеточные структуры, обогащённые некоторыми белками(например, coilin и TCAB1) и выполняющие ряд важных функций. В течение S фазы клеточногоцикла часть ТК ассоциированы с теломерами и теломеразной РНК, что позволилопредположить роль этих структур в синтезе теломер [158].

Компонент теломеразногокомплекса TCAB1 важен для локализации hTR в ТК и на теломеры [139]. В другой работе былапродемонстрирована важность другого компонента ТК – coilin для доставки hTR на теломеры, атакже была показана независимость функции TCAB1 от coilin в этом процессе присуперэкспрессии теломеразы [159].Тем не менее, привлечение теломеразы на теломеры скорее всего не является основнымрегулируемым событием в контроле длины теломер человека, по крайней мере, в том виде, какэто происходит в дрожжах.

Так, в отличие от S. cerevisiae (практически) каждая теломераудлиняется теломеразой, по крайней мере, в двух раковых линиях человека в условияхподдержания длины теломер [160]. При этом добавляется примерно 60 нт, синтезируемыхпроцессивно одной молекулой теломеразы. В условиях восстановления длины теломер (послеобработки клеток ингибитором), происходит повышение количества добавляемых нуклеотидов.Однако, это повышение происходит не за счёт увеличения процессивности теломеразы: скореепроисходит повышение числа молекул теломераз, удлиняющих эту теломеру [161].Нокдаун каждого из компонентов комплекса CST человека приводит к удлинениютеломер за счёт теломеразы [162].

Следовательно, несмотря на то, что CTC1 не являетсягомологом Cdc13 из S. cerevisiae, участие CST комплекса в контроле длины теломерсохранилось в процессе эволюции. CST человека связывает теломерную оцДНК, а также белкиTPP1 и POT1, и эти взаимодействия нарушают активность теломеразы in vitro. Наконец,обогащение CST на теломерах происходит в поздней S-фазе, и это обогащение зависит отработытеломеразы,следовательно,CSTпредпочтительносвязываетсясновосинтезированными теломерными повторами.

На основании этих данных, комплексу CSTбыла присвоена функция терминатора работы теломеразы. Существуют также данные обучастии CST в стимуляции работы полимеразы отстающей цепи (polα) [163], однако нетданных, свидетельствующих о каком-либо влиянии синтеза С-цепи на работу теломеразычеловека.362.4. ЗаключениеВ данном обзоре мы рассмотрели основные регуляторные пути, обеспечивающиеподдержание гомеостаза теломер, на трёх модельных организмах: почкующиеся дрожжи S.cerevisiae, делящиеся дрожжи S.

pombe и человек. Следует отметить, что за 30 лет, прошедшихсо времени открытия теломеразы, многие аспекты регуляции длины теломер были выяснены,несмотря на технические трудности, связанные с работой в теломеразной области. Тем неменее, детали механизмов контроля длины теломер неизвестны до сих пор даже для такогохорошо изученного организма, как S. cerevisiae.В S. cerevisiae основной регуляторный путь, обеспечивающий стабильную длинутеломер, осуществляется за счёт контроля ассоциации теломеразы с теломерами посредствомбелков Rap1-Rif1-Rif2-MRX/Tel1.

Rap1-Rif1-Rif2 являются своеобразным сенсором длинытеломер, а передача информации теломеразе опосредована комплексом MRX/Tel1 за счётмодуляции взаимодействия Cdc13-Est1. Этот регуляторный путь стал основой для пониманиягомеостаза теломер (во всех организмах): белки двуцепочечной части теломер ингибируютсвязывание теломеразы с белками одноцепочечной части теломер за счёт влияния нарегуляторный элемент.

Однако даже в этом тщательно изученном механизме существует многопробелов. Каким образом происходит стимуляция взаимодействия теломераза-теломерабелками комплекса MRX/Tel1? Роль белка Rif1 всё ещё остаётся загадочной.Следующий уровень сложности формируют дополнительные пути контроля работытеломеразы: Pif1 хеликаза, Tbf1, TERRA – важные участники биогенеза теломер, но их роль вподдержании стабильности теломер только начинает проясняться.

Более того, масштабныескрининги штаммов мутантных S. cerevisiae выявили более 300 генов, функция которых важнадля поддержания длины теломер [164]. Безусловно, полное понимание гомеостаза теломертребует построение сети взаимодействий продуктов всех этих генов.При рассмотрении контроля длины теломер в различных организмах поражаетзначительное различие в механизмах, осуществляющих этот контроль. Особенно ярко эторазличие проявляется при сравнении строения теломер почкующихся дрожжей и человека. Так,единственным общим компонентом теломерного хроматина S. cerevisiae и человека являетсябелок Rap1.

Однако и его функция не является консервативной в процессе эволюции: вS. cerevisiae Rap1 – один из главных участников регуляции теломеразы, тогда как hRap1 вноситлишь небольшой (пока невыясненный) вклад в поддержание стабильности теломер человека.Да и сам процесс удлинения теломер теломеразой значительно отличается между этими двумяорганизмами. Теломераза синтезирует ДНК лишь на некоторых теломерах, в то время каккаждая теломера человека удлиняется теломеразой при каждом делении.37И всё-таки общие закономерности могут быть выявлены.

Принцип «счёта белков» –ингибирование теломеразы белками двуцепочечной части теломер – сохраняется в процессеэволюции. Комплекс CST играет важную роль в регуляции теломеразы во всех трёхрассмотренных организмах. Некоторые общие детали наблюдаются между двумя организмами,но отсутствуют в третьем. Так, важность взаимодействий Est1 с теломеразной РНК и Est1 содним из белков одноцепочечной части теломер для привлечения теломеразы показано для S.cerevisiae и S. pombe, но в человеке такого не обнаружено. С другой стороны сама структурателомер более схожа у человека и S. pombe, чем у почкующихся и делящихся дрожжей.Также в данном обзоре мы рассмотрели регуляцию длины теломер в некототрых другихвидах почкующихся дрожжей.

Удивительно что, несмотря на относительную эволюционнуюблизость этой группы организмов, наблюдаются некоторые принципиальные различия вконтроле теломер. В C. albicans, белок Rap1 не имеет С-концевого домена для привлечения Rifбелков, а Cdc13 представляет собой гетеродимер и по всей видимости лишён способностивзаимодействия с Est1. Более того, ингибирование теломеразы C. albicans происходит порадикально другому механизму, чем в S. cerevisiae, не включающему Rap1, но включающемуKu70/Ku80 и CST.