Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 5

Удаление двух компонентов MRX комплекса (KlMre11 иKlRad50) приводит к коротким и стабильным теломерам [99], что также указывает на сходствомеханизмов контроля длины теломер в K. lactis and S. cerevisiae. Однако, степень удлинениятеломер в KlRap1-ΔC мутантах невелика в сравнении с радикальным нарушением регуляциителомер в мутантах ScRap1-ΔC [98]. Это может указывать на различие в степени участия Сконцевого домена Rap1 в регулировании длины теломер в этих двух видах дрожжей.

Посколькуосновной функцией С-концевого домена Rap1 S. cerevisiae считается ингибированиеассоциации киназы Tel1 с теломерами (посредством Rif белков), можно предположить, чтоKlTel1 играет меньшую роль, либо вовсе не участвует в поддержании теломер K. lactis.Основной же функцией KlRap1 тогда логично было бы считать ингибирование связываниеKlMRX комплекса с теломерами, подобно эффекту, оказываемому ScRap1 на ScMRX в штаммеΔtel1.Матричный участок KlTER относительно большой – 30 нт, и его можно условно разбитьна несколько функциональных областей (Рисунок 2.8) [96]. Два идентичных участка (5 нт) вначале и в конце матрицы нужны для правильной транслокации [100].

Мутации в области,кодируемой нуклеотидами 4-9, ведут к высокому уровню рекомбинации в субтеломерныхобластях, однако не очень сильно влияют на длину теломер. Мутации в правой половине сайтасвязывания KlRap1 (нуклеотиды 21-25) приводят к несколько укороченным теломерам (вотличие от мутаций в левой части KlRap1 сайта (нуклеотиды 16-20)), значит, этот участокможет выполнять особую функцию с положительным влиянием на длину теломер [96]. Особыйинтерес представляет собой участок, примыкающий к левой половине KlRap1 сайта(нуклеотиды 10-15): по крайней мере, некоторые мутации в этой области сначала вызываютукорочение теломер, однако, после дальнейшего культивирования мутантных штаммовтеломеры становятся очень длинными [96].

Связывание KlRap1 с теломерной ДНК из такихмутантных штаммов не нарушено, а суперэкспрессия KlRap1 не подавляет фенотипудлинённых теломер. Более того, одна из таких мутаций и KlRap1-ΔC синергетически влияютна длину теломер [98]. Теломеры в мутантных штаммах остаются длинными даже послеудаления KlRad52, а значит теломеры удлиняются не за счёт рекомбинации, а за счёт работытеломеразы [96].

Описанный фенотип может быть объяснён небольшим нарушениемвзаимодействия ДНК-KlRap1, однако, возможно этот эксперимент свидетельствует о22существовании дополнительного (Rap1-независимого) механизма контроля длины теломер K.lactis (Рисунок 2.9Б).Рисунок 2.8. Матричный участок теломеразной РНК K. lactis.

Функциональные областии теломерный фенотип мутаций в них.Делеция белка Rap1 в C. albicans приводит к тому, что теломеры становятся длинными игетерогенными [33], что свидетельствует о схожести функций, выполняемых белками CaRap1 иScRap1. Однако, есть ряд экспериментальных данных, позволяющих предполагать наличиесущественных различий в механизмах контроля длины теломер этими белками.

Негативныйэффект ScRap1 на длину теломер осуществляется посредством ингибирования теломеразы,поскольку ScRap1 ограничивает доступ теломеразы на теломеры; причём С-концевой доменявляется ключевым элементом в этом процессе. У CaRap1 отсутствует аналогичный домен, чтоговорит об отличном механизме действия CaRap1. Более того, теломераза не является мишеньюингибирующего действия CaRap1, поскольку удаление CaTERT не только не приводит кподавлению фенотипа в штамме Δrap1, но и усугубляет его [33]. Следовательно, основнойфункцией CaRap1 является подавление рекомбинации на теломерах.

Похожие фенотипынаблюдаются также в штаммах с делециями генов других теломерных белков C. albicans: KU70,STN1 и TEN1 [33]. Однако, в случае штамма Δten1 (возможно и Δstn1) длинные теломерыподдерживаются и за счёт теломеразы, и за счёт рекомбинации [101].

В штамме же Δku70избыточное удлинение теломер зависит только от теломеразы [102]. Логично сделатьпредположение, что доступность теломер для теломеразы в C. albicans регулируется23гетеродимером CaKu70/Ku80 и комплексом CaCST; а механизм "счёта белков" ("счёта Rap1"),описанный для S. cerevisiae, не реализуется в C. albicans (Рисунок 2.9В).Рисунок. 2.9.

Регуляция длины теломер в почкующихся дрожжах. Положительноедействие отображено стрелкой, ингибирующее – тупой стрелкой.242.2. Регуляция длины теломер делящихся дрожжей (Schizosaccharomyces pombe)2.2.1. Строение теломерПодобно теломерам S. cerevisiae теломеры S. pombe гетерогенны, консенсуснойпоследовательностью является G2–8TTAC(A), а наиболее часто встречающимся мотивомявляется TTACAGG [103].По структуре и белковому составу теломеры S.

pombe (Рисунок 2.10) больше похожи нателомеры млекопитающих. С двуцепочечной частью теломер связывается MYB-белок Taz1 –ортолог белков TRF1 и TRF2 млекопитающих. Taz1 связывает белок Rap1 – гомолог белка Rap1S. cerevisiae. В отличие от ScRap1, однако, SpRap1 не связывает двуцепочечную ДНК теломернапрямую. Rap1 в свою очередь связывает белок Poz1, Poz1 – Tpz1, а Tpz1 связывается с двумябелками:Ccq1иPot1[104].Pot1являетсяфактором,связывающимтеломернуюодноцепочечную ДНК [105]. Ccq1 играет ключевую роль в привлечении теломеразы нателомеры за счёт взаимодействия с Est1 [106, 107]. Таким образом, 3'-выступающий конецтеломеры и её внутренняя двуцепочечная часть оказываются соединёнными посредствомбелок-белковых взаимодействий в S.

pombe; такая структура теломер очень похожа наситуацию в млекопитающих. На теломеры S. pombe также привлекается белок Rif1 за счётвзаимодействия с Taz1 [108]. Несмотря на то, что гомолога белка ScCdc13 в S. pombeобнаружить пока не удалось, другие комплекса CST – Stn1 и Ten1 играют роль в защитетеломер S. pombe от слияния [109]. Комплекс Ku70/Ku80 также присутствует на теломерах S.pombe и выполняет защитную функцию [110, 111].Рисунок 2.10. Строение теломер S.

pombe.252.2.2. Теломераза S. pombeУ S. pombe помимо теломеразной РНК (TER1) и теломеразной обратной транскриптазы(Trt1) компонентами теломеразного комплекса являются белок Est1 и семь белков комплексаLsm2-8 [112]. Sm-белки (необходимые для стабильности TLC1 S. cerevisiae) также важны дляфункционирования TER1, поскольку они участвуют в биогенезе теломеразы S. pombe; однако,они заменяются на Lsm-белки в ходе процессинга TER1 и именно Lsm-белки являютсякомпонентами теломеразного комплекса S.

pombe [113]. SpEst1 необходим для привлечениятеломеразы на теломеры (подобно своему гомологу в S. cerevisiae), поскольку он связываетTER1 и один из компонентов теломерного хроматина – Ccq1.2.2.3. Регуляция длины теломер S. pombeУдаление гена taz1 приводит к значительному удлинению и повышению гетерогенностителомер [114].

Удлинения теломер при удалении гена taz1 в штамме Δtrt1 не наблюдается,значит теломераза ответственна за синтез теломер в этом случае [115]. Таким образом, факторсвязывания двуцепочечной части теломер в S. pombe (Taz1) негативно влияет на работутеломеразы. Это напоминает ситуацию в S. cerevisiae (только фактор другой – Rap1), и поэтомубыло сделано предположение о существовании в S. pombe системы "счёта белков", аналогичнойS. cerevisiae.Также подобно ситуации в S. cerevisiae белки, взаимодействующие с факторомсвязывания двуцепочечной части теломер (Rap1 и Rif1 в S. pombe), отвечают за регуляциюдлины теломер [108, 116].

В штамме Δrap1 теломеры удлиняются, причём их длина несколькобольше, чем в штамме Δtaz1. Однако, в двойном мутанте Δrap1Δtaz1 длина теломер такая же,как в Δtaz1. Теломеры штамма Δrif1 тоже длиннее, чем в штамме дикого типа, но степеньудлинения не такая значительная, как в штамме Δrap1. При этом теломеры штаммов Δrif1Δtaz1и Δtaz1 имеют одинаковую длину. Наиболее длинные теломеры наблюдали в штаммеΔrap1Δrif1, но при последующем удалении taz1 они укорачивались до длины штамма Δtaz1.

Этиэксперименты показывают, что ингибирование теломеразы белком Taz1 осуществляется двумянезависимыми путями: Rap1-зависимым и Rif1-зависимым. При этом Taz1 также оказываетнекое положительное влияние на длину теломер.Удаление гена poz1 приводит к Trt1-зависимому удлинению теломер [104]. ВведениеΔpoz1 мутации в штаммы Δtaz1 и Δrap1 не приводит к увеличению длины теломер в последних,что говорит о том, что Taz1-Rap1-зависимый путь ингибирования теломеразы на самом делеTaz1-Rap1-Poz1-зависимый.

Poz1 взаимодействует как с Rap1, так и с Tpz1, то есть он является26центральным звеном белкового мостика, соединяющего двуцепочечную часть теломеры содноцепочечной (Рисунок 2.10). Поскольку белки двуцепочечной части теломеры оказываютнегативное влияние на удлинение теломер теломеразой, а белки одноцепочечной части –положительное (о чём будет подробнее написано ниже), была предложена модель регуляциидлины теломер в S.

pombe (Рисунок 2.11) [104]. Согласно этой модели длинные теломерыдолжны находиться "закрытом" (недоступном для теломеразы) состоянии, поскольку онисвязывают большее количество Taz1-Rap1-Poz1 комплексов, а следовательно существуетбольшая вероятность взаимодействия с Ccq1-Tpz1-Pot1 комплексом и нивелированияоказываемого им положительного эффекта.Рисунок 2.11.

Модель регуляции теломер S. pombe .Каким же образом белки одноцепочечной части теломер (Ccq1, Tpz1 и Pot1)стимулируют ассоциацию теломеразы? Удаление генов tpz1 и pot1 быстро приводит к полнойпотере теломер и жизнеспособности клеток [104, 105], что свидетельствует о важностифункций соответствующих белков для защиты теломер, но с другой стороны этот факт непозволяет выяснить роль этих генов в привлечении теломеразы.

Напротив, удаление гена ccq1только приводит к значительному укорочению теломер [117]. Дальнейшие экспериментывыявили критическую роль Ccq1 в привлечении теломеразы на теломеры [104, 118]: Ccq1взаимодействует с теломеразой за счёт прямого взаимодействия с компонентом теломеразного27комплекса Est1 [107] , а на теломеры Ccq1 привлекается за счёт взаимодействия Ccq1-Tpz1Pot1.Важно отметить, что киназы Tel1 (гомолог ATM киназы) и Rad3 (гомолог ATR киназы)играют важную роль в поддержании теломер: следствием удаления соответствующих генов в S.pombe является нарушение ассоциации теломеразы с теломерами и полная потеря теломернойДНК [119, 120]. Мутация Δtel1Δrad3 также является причиной пониженной ассоциации Ccq1 стеломерами, что должно приводить к нарушению ассоциации теломеразы. Более того,выяснилось, что Tel1 и Rad3 фосфорилируют Ccq1 по остатку Thr93 и это фосфорилированиестимулирует взаимодействие Ccq1-Est1 [106].