Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha (1105689)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М. В. ЛОМОНОСОВА__________________________________________________________Химический факультетКафедра химии природных соединенийНа правах рукописиМАЛЯВКО АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧРЕГУЛЯЦИЯ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР ДРОЖЖЕЙHansenula polymorphaСпециальность 02.00.10 – биоорганическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучные руководители:д. х. н., профессор,член-корр. РАН Донцова О.А.к. х. н., доцент Зверева М.Э.Москва – 2014ОглавлениеОглавление ............................................................................................................................................... 2Список сокращений ................................................................................................................................ 41.
Введение ............................................................................................................................................... 52. Обзор литературы. Регуляция длины теломер ................................................................................. 62.1. Регуляция длины теломер почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica) ...............................................................................
82.1.1. Строение теломер ....................................................................................................................... 92.1.2. Теломераза почкующихся дрожжей ........................................................................................ 122.1.3. Регуляция длины теломер Saccharomyces cerevisiae...............................................................
132.1.4. Регуляция длины теломер других почкующихся дрожжей ................................................... 212.2. Регуляция длины теломер делящихся дрожжей (Schizosaccharomyces pombe) ....................... 252.2.1. Строение теломер ..................................................................................................................... 252.2.2. Теломераза S.
pombe................................................................................................................... 262.2.3. Регуляция длины теломер S. pombe .......................................................................................... 262.3. Регуляция длины теломер человека (Homo sapiens) ................................................................... 322.3.1. Строение теломер человека .....................................................................................................
322.3.2. Теломераза человека .................................................................................................................. 332.3.3. Регуляция теломеразы на теломерах ...................................................................................... 332.4. Заключение ..................................................................................................................................... 373. Результаты и обсуждение ................................................................................................................. 393.1. Постановка задачи ..........................................................................................................................
393.2. Обратная транскрипция А170 ....................................................................................................... 423.2.1. Детекция дополнительного dT на теломерах in vivo ............................................................. 423.2.2. Влияние мутаций нуклеотида А170 HpTER на длину теломер ............................................. 463.2.3. Обратная транскрипция А170, как способ контроля длины теломер................................. 523.3.
Регуляция длины теломер H. polymorpha. Теломерные белки .................................................. 553.4. Заключение ..................................................................................................................................... 6524. Материалы и методы......................................................................................................................... 664.1.
Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы ...... 664.2. Методики, использованные в работе ........................................................................................... 714.2.1. Базовые методики работы с ДНК и клетками, клонирование ............................................. 714.2.2. Определение последовательностей теломер H. polymorpha ................................................ 764.2.3. Получение штаммов, экспрессирующих мутантные формы HpTER .................................. 774.2.4. Саузерн блот анализ концевых рестрикционных фрагментов ............................................. 784.2.5. Получение штаммов Rap1A-ΔC-HA и Rap1B-HA ....................................................................
804.2.6. Получение «нокаутных» штаммов .......................................................................................... 824.2.7. Иммунопреципитация хроматина ........................................................................................... 835. Выводы ............................................................................................................................................... 866.
Список литературы ........................................................................................................................... 873Список сокращенийДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаРНК – рибонуклеиновая кислотаTR – теломеразная РНКTERT – теломеразная обратная транскриптазаRPA – Replication Protein AChIP – иммунопреципитация хроматинаоцДНК – одноцепочечная ДНКдцДНК – двуцепочечная ДНКTRD – быстрое удаление теломерымяоРНК – малая ядрышковая РНКПЦР – полимеразная цепная реакциянт – нуклеотидпн – пара нуклеотидовтпн – тысяча пар нуклеотидовНА – гемагглютининНА-таг – гемагглютининовый тагНА-агароза – агароза, ковалентно модифицированная антителами к гемагглютининуWT – дикий типTris – трис(гидроксиметил)аминометанЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрияДСН – додецилсульфат натрияДТТ – 1,4-дитио-DL-треитолПМСФ – фенилметилсульфонилфторидБСА – бычий сывороточный альбуминdNTP – дезоксинуклеотидтрифосфатыДМСО – диметилсульфоксидPEG4000 – полиэтиленгликоль 4000ScRap1 – Rap1 из Saccharomyces cerevisiae.
Аналогично для других белков и другихвидов дрожжей, например, KlRif1 – Rif1 из Kluyveromyces lactis. mRap1 – Rap1 мыши, hRap1 –Rap1 человека. Аналогично для других белков мыши и человека.41. ВведениеКонцы эукариотических хромосом (теломеры) имеют структуру отличную отвнутренних участков хромосом.
Особое строение теломер позволяет им выполнять важнейшиефункции. Например, теломеры осуществляют защиту хромосом от слияния и деградации, чтонеобходимо для поддержания стабильности генома и жизнеспособности клеток. Однако, врезультате недорепликации при каждом клеточном делении хромосомы соматических клетокэукариот теряют теломерную ДНК, и по достижении теломерами критической длины клеткивходят в особое состояние (сенессенс) и, в конечном счёте, гибнут.Теломераза – ферментативный комплекс, способный синтезировать теломерную ДНК,поддерживая длину теломер на нормальном уровне.
Неограниченный пролиферативныйпотенциал одноклеточных эукариот, половых и стволовых клеток поддерживается за счёттеломеразы. Примечательно, что большинство типов раковых клеток также активируеттеломеразу, и это придаёт им возможность делиться бесконечно. Поэтому теломераза являетсяпривлекательной мишенью для противоопухолевой терапии [1, 2].Стабильность генома обеспечивается контролем длины теломер, что включает в себярегуляцию различных и иногда противоположных по действию ферментов: нуклеаз,репликативных полимераз и теломеразы. Тем не менее, многие аспекты регуляции длинытеломер до сих пор остаются невыясненными.За последние десятилетия было изучено множество факторов, отвечающих за контрольдлины теломер одноклеточных организмов, в частности – дрожжей Saccharomyces cerevisiae [3].Однако, детали функционирования теломерных белков и теломеразы человека сильноотличаются от таковых в S. cerevisiae [4]. Сравнительный анализ может выявитьконсервативные и видоспецифические аспекты регуляции длины теломер, поэтому изучениедругих видов почкующихся дрожжей является актуальной задачей.Данная работа посвящена изучению регуляции длины теломер дрожжей Hansenulapolymorpha.
Этот модельный организм, сохраняя преимущества работы с простейшимиэукариотами,обладаетрядомособыхинтересныхсвойств.H.polymorphaявляетсятермотолерантным организмом, что должно облегчать in vitro работу с его молекулярнымикомпонентами. Также H. polymorpha отличается от S. cerevisiae особенно короткимителомерами и гомогенностью теломерных повторов, что делает изучение регуляции длинытеломер дрожжей H. polymorpha интересной и актуальной задачей.52.
Обзор литературы. Регуляция длины теломерКонцы хромосом, по сути, представляют собой двуцепочечные разрывы в геноме.Репарация разрывов ДНК является необходимой для сохранения генетической информации.Для этого клетки используют сложные механизмы с участием огромного количества белков.Однако, узнавание теломер как разрывов такими белками привела бы к слипанию хромосом,что в свою очередь привело бы к катастрофическим последствиям. Поэтому защита концовхромосом от систем репарации двуцепочечных разрывов является, пожалуй, основнойфункцией теломер. Защитные функции теломер реализуются благодаря особому их строению.Теломерная ДНК состоит из повторяющихся коротких G/С-богатых последовательностей.Различают двуцепочечную часть теломер и одноцепочечную (3'-выступающий конец). Скаждой из этих частей связывается специфический набор белков.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
