Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 4

cerevisiae, влитературе описан ряд других механизмов.Фактор транскрипции Tbf1 (а также Reb1) укорачивает теломеры, если сайт связыванияэтого белка расположить вблизи повторов TG1-3 [30]. Однако, этот эффект не исчезает (анаоборот, проявляется сильнее) в штамме с делецией гена TEL1. В штамме Δtel1 частотаудлинения теломеразой больше не зависит от длины искусственной теломеры, что согласуется свыключением основного механизма Rap1-Rif1-Rif2-MRX/Tel1 [75]. Однако при введении втакую теломеру сайтов связывания Tbf1 этот эффект пропадает.

Равно как и в случае теломерыприродной хромосомы (содержащей Tbf1 сайт) – частота удлинения теломеразой зависит отдлины в штамме Δtel1. Практически все хромосомы S. cerevisiae в своих субтеломерныхобластях содержат сайты связывания Tbf1. Таким образом, существует ещё один механизмконтроля длины теломер S. cerevisiae – механизм зависимый от Tbf1 белка. Объяснениемнаблюдаемого эффекта может служить результат, полученный в другой работе: Tbf1 и Rap1скооперировано нарушают ассоциацию MRX комплекса с концами ДНК [76].

N-концевойучасток белка Tbf1 необходим для такого ингибирования, однако ни С-концевой домен Rap1,ни Rif1 или Rif2 не нужны. Важность N-конца Tbf1 для контроля длины теломерпродемонстрирована и в некоторых других работах [30, 75].СпособностьTbf1участвоватьврегуляциителомерпродемонстрированаэкспериментами в мутантных дрожжах с так называемыми "гуманизированными" теломерами.Теломерные повторы TG1-3 S. cerevisiae могут быть заменены на канонические TTAGGGповторы человека при введении соответствующих мутаций в матричный участок TLC1.Получаемые теломеры связаны белком Tbf1 (а не Rap1 в отличие от обычных повторов TG1-3 вто время как белки Rap1, Rif1 и Rif2 не участвуют в регуляции таких теломер [77].

Деталимеханизма регуляции длины таких теломер были прояснены экспериментами по связыванию сДНК, заканчивающимися повторами TTAGGG разной длины [78]. Так, связывание MRX сДНК, содержащей на конце 230 пн TTAGGG, ингибируется белком Tbf1, тогда как с болеекоротким участком TTAGGG (длиной в 60 пн) связывается больше MRX. Также с 60 пнTTAGGG теломерами ассоциируется больше Est1 и Est2, чем с длинными. Связываниетеломеразы с короткими концами не нарушалось при удалении гена TEL1, однакоэффективность добавления нуклеотидов при этом сильно уменьшалась в штамме Δtel1. Врезультате можно сделать вывод о том, что Tbf1 регулирует ассоциацию теломеразы сTTAGGG теломерами посредством ингибирования MRX комплекса, но не Tel1 киназы;16несмотря на необходимость Tel1 киназы для работы теломеразы (в "гуманизированном"штамме с мутацией Δtel1 теломеры короткие).Ещё одним негативным регулятором длины теломер S. cerevisiae является 5'-3' ДНКхеликаза Pif1.

Совместное удаление Rif белков и Pif1 приводит к суммарному увеличениюдлины теломер, следовательно, регуляторные пути этих белков различны [62, 79]. Pif1уменьшаеттеломеразнуюактивностьinvitro,разрушаявзаимодействиетеломераза-олигонуклеотид [80]. Вероятно, что in vivo Pif1 хеликаза действует аналогично, поскольку приеё суперэкспрессии снижается уровень Est1 и Est2, связанных с теломерами [81].Взаимодействие с доменом "палец" Est2 необходимо для выполнения функции Pif1 [82]. Pif1предпочтительно ассоциирует с длинными теломерами, что объясняет её роль в регуляциидлины теломер [3].Существует особый способ укоротить аномально удлинённые теломеры с помощью"быстрого удаления теломеры" (TRD, telomere rapid deletion) (Рисунок 2.5).

Этот процесспроисходит с довольно высокой частотой в клетках дикого типа: существует ~4% вероятностьтого, что одна из теломер в гаплоидной клетке подвергнется "быстрому удалению" при каждомклеточном делении [32]. Механизмом TRD является интерхроматидная рекомбинация: 3'выступающий конец теломеры внедряется в двуцепочечную часть хромосомы и теломерныеповторы образующейся петли вырезаются с образованием кольцевого фрагмента ДНК вкачестве побочного продукта [83]. Этот процесс поражает своей точностью: теломерыукорачиваются до длины равной средней длине большинства теломер в клетке.

Каким образомдостигается такая точность пока не понятно. Две субъединицы MRX комплекса Mre11 и Rad50являются необходимыми для эффективного TRD. Отдельно отмечают сложную роль Mre11 впроцессе TRD, поскольку различные мутации могут приводить как к повышению, так ипонижению эффективности "быстрого удаления теломеры" [84].17Рисунок 2.5. Схема "быстрого удаления теломеры" (TRD) [85].18Гены, примыкающие к теломерам, подвержены особому типу замалчивания известномупод названием "теломерного позиционного эффекта" (TPE, telomere position effect) [86]. Тем неменее, в субтеломерных областях располагаются промоторы, направленные в сторону концовхромосом.

Продуктом транскрипции с таких промоторов является особый класс некодирующихРНК – TERRA [87]. TERRA синтезируется РНК полимеразой II и представляет из себяполиаденилированные транскрипты длиной от 100 до 1200 нт, состоящих частично из РНКвариантов субтеломерных последовательностей и частично из теломерных повторов. Онаявляется важным компонентом теломерного хроматина [88].TERRA регулирует длину теломер. В клетках S.

cerevisiae дикого типа уровеньтранскрипции TERRA очень низкий и для её детекции необходимо нарушение функции Rat1экзонуклеазы [89]. В штамме с мутацией rat1-1 (содержащим повышенное количество TERRA)теломеры укорачиваются за счёт ингибирования теломеразы [89]. В другой работе индукциятранскрипции TERRA с одной из теломер приводила к укорочению этой теломеры, однако, вэтом случае укорочение происходило независимо от активности теломеразы. В этом случаеобнаружилось, что TERRA нарушает способность белков Ku70/Ku80 защищать теломеры отдеградации экзонуклеазой Exo1 [90]. В этих экспериментах TERRA играет роль негативногорегулятора длины теломер.Rap1 контролирует уровень TERRA в клетке несколькими регуляторными путями(Рисунок 2.6) [91].

С-концевой домен Rap1 стимулирует Rat1-зависимую деградацию TERRA.Вдобавок, белки-партнёры Rap1 ингибируют транскрипцию TERRA. Такое ингибированиезависит от типа теломер. Теломеры S. cerevisiae различаются по содержанию в субтеломерныхобластях особых повторяющихся последовательностей – X- и Y'-элементов.

X-элементынаходятся практически во всех субтеломерных областях, тогда как Y'-элементы присутствуютне всегда. Транскрипция TERRA с теломер, содержащих только X-элементы в субтеломернойобласти, зависит в большей степени от Sir белков, тогда как ингибирование TERRA на Y'содержащих теломерах осуществляется в основном белками Rif1 и Rif2. Стоит отметить, чтобелок Rif1 оказывает более сильное ингибирующее действие на транскрипцию TERRA, чемRif2.19Рисунок 2.6.

Механизмы ингибирования TERRA теломерными белками на X- и Y’теломерах. RNAPII – РНК полимераза II [91].Неожиданный результат был получен в экспериментах по наблюдению за единичнымимолекулами TERRA [92]. Примерно 10% клеток, экспрессирующих меченную TERRA с однойиз теломер, содержали локусы TERRA возле периферии ядра; а в S фазе происходиласовместная локализация этих локусов с теломерами, с которых осуществлялась транскрипцияTERRA.

Мечение молекул TLC1, теломеры 6R и TERRA получаемую с теломеры 6R позволилонаблюдать за всеми тремя молекулами in vivo одновременно. Оказалось, что локусы,образуемые TERRA и TLC1 совместно локализовались во время S фазы, а затем происходиласовместная локализация обоих локусов с теломерой 6R. Более того, индукция транскрипцииTERRA осуществлялась преимущественно с коротких теломер, которые в свою очередьявляются предпочтительными субстратами теломеразы. Сделанные эксперименты позволилиавторам работы построить модель регуляции длины теломер с участием TERRA. Согласно этоймодели, укорочение теломер запускает транскрипцию TERRA, TERRA формирует локус,который в свою очередь формирует кластер молекул теломеразы способных к удлинениютеломер, а эти кластеры направляются на теломеры, с которых происходила транскрипцияTERRA.

В построенной модели (Рисунок 2.7) TERRA выступает в качестве (ключевого)положительного регулятора длины теломер, что несколько противоречит выводам о негативномвлиянии TERRA, сделанным в описанных выше работах [93].20Рисунок 2.7. TERRA, как положительный регулятор длины теломер [92].К удлинению теломер приводят мутации в некоторых белках репликативного аппарата:например, Rfc1 (репликативный фактор С) и Pol1 (ДНК-праймаза) [94].

На основании этого,предполагают, что синтез G-цепи теломеразой и С-цепи полимеразой отстающей цепи связаныкаким-то образом. Обнаружено, что эта связь осуществляется через комплекс CST: Cdc13 иStn1 взаимодействуют с праймазой Pol1, в то же время Cdc13 взаимодействует с теломеразой[23, 95]. Детали механизма ингибирования теломеразы посредством синтеза С-цепи поканеясны.2.1.4. Регуляция длины теломер других почкующихся дрожжейПомимо S. cerevisiae контроль длины теломер был изучен в двух других видахпочкующихся дрожжей: Kluyveromyces lactis и Candida albicans. Однако, степень ихизученности несравненно меньше, чем S.

cerevisiae. Тем не менее, в этой главе мы попыталисьвывести механизмы, действующие в этих двух видах дрожжей, на основании результатовнемногочисленных экспериментов и сравнении их с аналогичными для S. cerevisiae.Некоторые мутации в матричном участке теломеразной РНК K.

lactis приводят кнеконтролируемому удлинению теломер теломеразой [96, 97]; при введении таких мутаций вДНК теломер K. lactis происходит нарушение связывания KlRap1 с теломерами, а21суперэкспрессия KlRap1 приводит, по меньшей мере, к частичному подавлению фенотипадлинных теломер, наблюдаемому в данных мутантах. Следовательно, KlRap1 контролируетдлину теломер в K. lactis. Удаление 31 С-концевой аминокислоты KlRap1 (KlRap1-ΔC) такжеприводит к удлинению теломер [98], что свидетельствует в пользу того, что для осуществлениянегативного эффекта белка KlRap1 на длину теломер необходим С-концевой домен, как и вслучае его гомолога в S. cerevisiae.