Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha, страница 9

Частота встречаемости каждого из вариантов концевого теломерногоповтора.В результате оказалось, что подавляющее большинство (90%) всех проанализированныхконцевых повторов представлено последовательностью 5’-GGGTGGCGT-3’. Этот результатсвидетельствует в пользу того, что практически каждая теломера в клетке H. polymorphaсодержит дополнительный dT на самом 3’-конце.

Геномная ДНК для данного экспериментавыделялась из несинхронизированных по клеточному циклу клеток. Значит, остальныеварианты концевых повторов могут представлять собой теломеры, потерявшие концевой dT врезультате недорепликации, но ещё не успевшие удлиниться теломеразой.

Вклад в частотуповторов без dT может также вносить деградация ДНК в процессе выделения. С учётом этогоможно предположить, что обратная транскрипция А170 происходит при каждом раунде синтезателомерной ДНК теломеразой.Полученные в этом эксперименте данные позволяют сделать ещё один интересныйвывод. Дело в том, что при каждом раунде репликации 50% теломер неизбежно должны терятьчасть нуклеотидов с 3’-конца (проблема недорепликации, см. введение в «Обзор литературы»),включая дополнительный dT нуклеотид.

Наблюдаемое присутствие dT практически на каждойтеломере означает, что теломераза синтезирует ДНК, по меньшей мере, на 50% теломер вкаждой S фазе клеточного цикла. Однако, нельзя исключить возможности того, что оставшиеся4550% теломер (сохранившие дополнительный dT) также удлиняются теломеразой: можнопредположить существование специального механизма удаления dT экзонуклеазой. В любомслучае, эти выводы свидетельствуют о различиях в регуляции работы теломеразы на теломерахмежду H. polymorpha и S. cerevisiae, поскольку менее 10% теломер S.

cerevisiae удлиняютсятеломеразой при каждом делении [57].3.2.2. Влияние мутаций нуклеотида А170 HpTER на длину теломерДля того, чтобы изучить функциональное значение обратной транскрипции А170 ивключения дополнительного dT на конец теломеры, мы провели мутагенез матричного участкаHpTER. В первую очередь мы заменили нуклеотид А170 в матричном участке на каждый изтрёх других возможных нуклеотидов (А170U, А170С, А170G).Для получения штаммов H. polymorpha, экспрессирующих мутантные формы HpTER,штамм, в котором удалён ген теломеразной РНК (ΔHpTER), был трансформирован плазмидами,несущими ген HpTER с мутацией. Длина теломер в полученных штаммах измерялась методомСаузерн блот анализа концевых рестрикционных фрагментов. Этот метод заключается вобработке геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, разделении полученных фрагментов вагарозном геле, переносе ДНК на мембрану и визуализации фрагментов, содержащихтеломерные повторы, гибридизацией с радиоактивно-меченным олигонуклеотидом 5’(GGGTGGCG)4-3’.

По разнице в подвижности в агарозном геле фрагментов, содержащихтеломерные повторы, можно судить о длине теломер.Результаты измерения длины теломер в штаммах с мутациями А170U, А170С и А170Gпредставлен на рисунке 3.6. Из полученных данных видно, что введение мутации теломерыА170С в матричный участок теломеразной РНК H. polymorpha приводит к значительномуувеличению длины теломер. Возрастает как средняя длина, так и гетерогенность длины.

В то жевремя мутации А170U и А170G практически не влияют на длину теломер.46Рисунок 3.6. Саузерн блот анализ концевых рестрикционных фрагментов в штаммах смутациями А170С (дорожки 3, 4), А170U (дорожки 5, 6) и А170G (дорожки 7, 8). В качествеконтроля использовали штамм ΔHpTER, трансформированный плазмидой с геном HpTERдикого типа (WT, дорожки 1 и 2). М – маркер.Рисунок 3.7. Схема влияния мутаций А170 на синтез теломерной ДНК теломеразой.47Каким же образом мутация А170С может приводить к увеличению длины теломер? Дляответа на этот вопрос нужно сравнить между собой продукты удлинения теломеразой сразличными нуклеотидами в положении 170 матричного участка HpTER (Рисунок 3.7).

Если вположении 170 находится аденозин (ситуация дикого типа), то в результате синтеза теломернойДНК последним нуклеотидом оказывается «нетеломерный» dT. Как уже упоминалось, такойпродукт действия теломеразы не может быть использован для синтеза следующего теломерногоповтора до тех пор, пока дополнительный dT не будет удалён с 3’-конца ДНК. Необходимостьпроведения этого дополнительного шага должна ограничивать работу теломеразы.

В случаемутаций A170G и A170U в HpTER, продукт удлинения теломеразой также не может являтьсясубстратом теломеразы, ведь на 3’-конец теломер присоединяются нуклеотиды (dC и dA), неприсутствующие в данном положении теломерных повторов в норме (Рисунок 3.7). Напротив,замена аденозина в 170-м положении на цитозин радикально изменяет ситуацию. В качествепоследнего нуклеотида теломераза с мутацией А170С добавляет dG – нуклеотид, который идолжен находиться в этом месте повтора.

Продукт работы теломеразы оказывается полностьюкомплементарным началу матричного участка, следовательно, мутация А170С в HpTERснимает необходимость удаления 3’-концевого нуклеотида перед следующим раундом синтезателомерного повтора (Рисунок 3.7). Это должно приводить к увеличению числа теломерныхповторов, добавленных теломеразой. Действительно, наблюдаемая в данном экспериментедлина теломер в штаммах с мутациями A170G и A170U практически не отличается от штаммадикого типа (Рисунок 3.6), тогда как результатом введения мутации A170C являютсяудлинённые и гетерогенные теломеры в соответствующем штамме (Рисунок 3.6).С другой стороны, полученному результату могут быть даны альтернативныеобъяснения. Например, мутация А170С (но не A170G и A170U) в матричном участке HpTERможет приводить к снижению эффективности добавления дополнительного нуклеотида.

Этотакже привело бы к возможности использования продукта синтеза теломеразой, безнеобходимости дополнительного шага удаления 3’-концевого нуклеотида. Ещё однойальтернативой является нарушение взаимодействия с теломерным 3’-выступающим концомфактора связывания одноцепочечной части теломеры. На примере делящихся дрожжей ичеловека было показано, как связывание таких факторов важно для регуляции работытеломеразы и длины теломер.Для того чтобы опровергнуть эти альтернативные объяснения и подтвердить нашепредположение о влиянии встраивания дополнительного нуклеотида на способностьтеломеразы использовать продукт своей работы повторно без лишнего шага, мы создали ещёдва штамма с мутациями в матричном участке HpTER (Рисунок 3.8).

Одна из мутаций – замена48цитозина в положении 178 на аденозин (С178А). Такая мутация придаёт способностьтеломеразе репозиционировать теломерный повтор с дополнительным нуклеотидом на конце неза счёт изменения природы дополнительного нуклеотида, а за счёт изменения природы участкаматрицы HpTER, используемого для отжига.

Другая мутация – дополнительная к А170С заменацитидина в положении 171 на аденозин (A170C/C171A, далее – СА170АС). При действиителомеразы с такой двойной мутацией снова возникает необходимость в удалении (уже двух)3’-концевых нуклеотидов для эффективного повторного использования продукта своей работы.В то время как мутация С178А должна приводить к удлинению теломер (примерноаналогичному ситуации в А170С), теломеры в штамме с мутацией СА170АС в теломеразнойРНК должны снова стать короткими и гомогенными (Рисунок 3.8).Длина теломер в штаммах, экспрессирующих HpTER с мутациями С178А и СА170АС,была проанализирована методом Саузерн блоттинга концевых рестрикционных фрагментов.Результаты представлены на рисунке 3.8.

Из данных, изображённых на этом рисунке, видно,что введение мутации С178А в HpTER приводит к удлинению теломер и увеличениюгетерогенности их длины; причём теломеры в штамме с такой мутацией подобны теломерам вштамме с мутацией А170С (ср. дорожки 7, 8 и 1, 2). Это согласуется с нашим предположениемо том, что мутация С178А должна приводить к повышению способности теломеразыиспользовать продукт своей работы повторно. С другой стороны, согласно нашемупредположению, замена С171А подавляет фенотип штамма А170С – теломеры в штамме сдвойной мутацией СА170АС короткие и гомогенные (Рисунок 3.8, дорожки 3, 4 и 1, 2), как вштамме дикого типа (даже несколько короче; Рисунок 3.8, дорожки 3, 4 и 5, 6).49AБРисунок 3.8. Влияние мутаций С178А и АС170СА в матричном участке HpTER на длинутеломер.

А. Схема влияния мутаций С178А и АС170СА на синтез теломерной ДНКтеломеразой. Б. Саузерн блот анализ концевых рестрикционных фрагментов в штаммах смутациями С178А (дорожки 7, 8) и АС170СА (дорожки 3, 4). В качестве контроля использовалиштамм ΔHpTER, трансформированный плазмидой с геном HpTER дикого типа (WT, дорожки 5и 6); а также штамм с мутацией А170С (дорожки 1, 2).

М – маркер.50Для дополнительного подтверждения полученных данных, мы провели измерениетеломер в штаммах с описанными мутациями в HpTER альтернативным методом – методом«теломерного» ПЦР, используемым ранее для определения последовательности последнеготеломерного повтора. Данный метод позволяет получить фрагменты ДНК, содержащиетеломерные повторы одной из теломер H. polymorpha. О длине теломер можно судить поподвижности получаемых фрагментов в агарозном геле.

Для контроля специфичности, такжепроводили ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК без предварительноголигирования «адаптера».Результаты измерения длины теломер этим методом в штаммах с мутациями матричногоучастка HpTER представлены на рисунке 3.9. Теломеры в штаммах А170G и АС170САкороткие и гомогенные (аналогично ситуации в штамме дикого типа), тогда как в штаммахА170С и С178А теломеры удлинённые и гетерогенные. Стоит отметить, что наблюдаемый вдорожках А170С и С178А продукт короткой длины является неспецифическим, посколькуточно такой же продукт получается в контрольном опыте (Рисунок 3.9). Данные, полученныеэтим методом и методом Саузерн блоттинга, полностью согласуются между собой.Рисунок 3.9.

Длина теломер в мутантных штаммах, измеренная методом «теломерного»ПЦР. М – маркер.513.2.3. Обратная транскрипция А170, как способ контроля длины теломерТаким образом, в данном разделе мы показали, что обратная транскрипция нуклеотидаА170 матричного участка HpTER (и встраивание дополнительного dT нуклеотида) происходитin vivo и этот процесс ограничивает длину теломер H. polymorpha. Причём, ограничение длинытеломер происходит за счёт нарушения способности продукта удлинения теломеразойрепозиционироваться в начало матричного участка. Существует несколько аспектов работытеломеразы, которые могли бы регулироваться обратной транскрипцией А170.В первую очередь логично предположить, что встраивание дополнительного dT должноснижать число теломерных повторов, добавленных за один раунд работы теломеразы(процессивность типа II).

Процессивность II-го типа играет важнейшую роль в поддержаниителомер человека: обнаружены ассоциированные с болезнями мутации в hTERT, влияющиеспецифически на процессивность [173, 174, 175]. Теломераза дрожжей S. cerevisiae, напротив, вбольшинстве случаев непроцессивна in vitro и in vivo [176, 177], тем не менее, детектировалипроцессивное удлинение теломеразой S. cerevisiae очень коротких теломер [177].