Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha (1105689), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Штаммы, использовавшиеся в работе.ШтаммDL1-lОписание штаммаH. polymorphaDL-1 (ATCC 26012) leu2daduADL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3ΔHpTERDL-1 (ATCC 26012) leu2 HpTER::HpLEU2Rap1A-ΔC-HADL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 Rap1AΔ466-613-3HA::HpURA3Rap1B-HADL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 Rap1B-3HA::HpURA3RАΔCΔRBΔrap1BDL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 Rap1AΔ466-613-3HA::HpURA3rap1B::HpLEU2DL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 rap1B::HpLEU2Δrif1DL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 rif1::HpLEU2Δte11DL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 tel1::HpLEU2Δmre11DL-1 (ATCC 26012) leu2 ura3 mre11::HpLEU2JM-109E.
colie14- (McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+)supE44relA1 (lac-proAB) (F' traD36 proAB lacIqZ M15)704.2. Методики, использованные в работе4.2.1. Базовые методики работы с ДНК и клетками, клонирование4.2.1.1. Выделение плазмидВыделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора реагентов для выделенияплазмидной ДНК фирмы Thermo Scientific согласно протоколу производителя.Колонию клеток штамма JM109 E. сoli помещали в 5 мл среды LB, содержавшейсоответствующий антибиотик, и инкубировали при перемешивании в течение 16 ч на 37°С.Клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин 5 мин, ресуспендировали в 250 мклраствора Resuspension solution (Thermo Scientific), добавляли 250 мкл раствора Lysis solution,перемешивали до образования вязкого раствора.
К полученному раствору добавляли 350 мклраствора Neutralization solution (Thermo Scientific), перемешивали до появления белых хлопьев.Суспензию осаждали центрифугированием при 14000 об/мин 5 мин, отбирали супернатант ипропускали его через колонку для выделения ДНК (Thermo Scientific), промывали эту колонку 2раза по 500 мкл буферного раствора Wash solution (Thermo Scientific).
Элюировали с колонкиДНК 30 мкл буферного раствора Elution buffer (Thermo Scientific).4.2.1.2. ПЦРСоставляли следующую смесь:10х буферный раствор для Pfu-полимеразы10 мкл(с MgSO4)смесь dNTP (25 мМ каждого)0,4 мклпраймер 130 пмольпраймер 230 пмольгДНК300 нгPfu полимераза1 мклН2Одо 50 мклПараметры ПЦР:30 циклов:предварительный прогрев 95С 5 мин,95С 30 с,58С 30 с,72С 1 мин,в конце программы 72С 10 мин.71После проведения ПЦР фрагменты ДНК выделяли при помощи набора дляочистки ПЦР продуктов (Thermo Scientific) согласно протоколу производителя.4.2.1.3.
Приготовление векторов и вставокСоставляли следующую реакционную смесь:ДНК1–4 мкг10х буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции2 мклэндонуклеаза рестрикции10 едН2Одо 20 мклПолученную смесь инкубировали при 37˚С в течение 1 ч. Добавляли 4 мкл буфера длянанесения, наносили на агарозный гель и приводили разделение фрагментов ДНК. ДНКфрагмент нужной длины вырезали из геля и выделяли с помощью набора реагентов длявыделения ДНК из агарозного геля (Thermo Scientific).4.2.1.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном гелеДля приготовления агарозного геля добавляли нужное количество агарозы к 100 млраствора 1xTBE (1% гель - 1 г агарозы на 100 мл раствора 1xTBE).
Раствор прогревали вмикроволновой печи до полного растворения агарозы, но не допуская кипения. Послеполученный раствор охлаждали до ~ 40–50°С, добавляли 5 мкл водного раствора бромистогоэтидия 10 мг/мл, перемешивали, выливали в плашку. После застывания геля вносили образцы вячейки и проводили электрофорез при силе тока ~ 100 мА. Фотографировали гель припомощью камеры с УФ лампой (прибор ChemiDoc (Bio-Rad)).4.2.1.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геляВыделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с помощью набора реагентовдля выделения фрагментов ДНК из агарозного геля фирмы Thermo Scientific согласнопротоколу с использованием фирменных реагентов.
Полоску агарозного геля массой ~ 100 мкг,содержавшую нужный фрагмент ДНК, растворяли в 150 мкл буферного раствора Binding buffer(Thermo Scientific) при 55°С до полного растворения геля. Добавляли 100 мкл изопропиловогоспирта, перемешивали переворачиванием, пропускали через колонку для выделения ДНК(Thermo Scientific). Промывали колонку 750 мкл буферного раствораWash solution (ThermoScientific), элюировали ДНК 30 мкл буферного раствора Elution Buffer (Thermo Scientific).72Концентрацию ДНК определяли по поглощению при 260 нм.4.2.1.6.
ЛигированиеСоставляли следующую смесь:Вектор50 нгВставка10–50 нг (3х–10х мольныйизбыток к вектору)5х буферный раствор для Т4 ДНК-лигазы4 мклТ4 ДНК-лигаза1 мклН2Одо 20 мклИнкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Полученной лигазной смесьютрансформировали компетентные клетки E. coli.4.2.1.7. Приготовление компетентных клеток E.
coliСвежую колонию клеток E. сoli помещали в 50 мл среды SOB и инкубировали притемпературе 18С при перемешивании (125 об/мин) до оптической плотности А600 ~ 0,6.Культуру клеток выдерживали в течение 10 мин во льду, переносили в центрифужныепробирки и осаждали центрифугированием в роторе JA 14 при 5000 об/мин, 4С в течение 10мин.
Супернатант сливали и ресуспендировали осадок в 20 мл охлажденного до 4С буферногораствора ТВ. Суспензию клеток инкубировали при помешивании при 0С 10 мин. Клеткиосаждали центрифугированием в роторе JA 14 при 5000 об/мин, 4С 10 мин, промывали 20 млбуферного раствора ТВ, инкубировали при 0С 10 мин и осаждали центрифугированием.Клетки ресуспендировали в 4 мл буферного раствора ТВ, добавляли 280 мкл ДМСО (до 7%) иинкубировали 10 мин при 0С. Суспензию клеток переносили по 200 мкл в 1,5 мл стерильныепробирки и быстро замораживали в жидком азоте.
Клетки хранили при температуре –70С.4.2.1.8. Трансформация компетентных клеток E. coliПробирку с компетентными клетками 200 мкл размораживали во льду, добавляли 1–5мкл раствора плазмидной ДНК (~ 0,1 мкг) или лигазную смесь и инкубировали 30 мин при 0С.Затем прогревали смесь на водяной бане в течение 40–50 сек при 42С, охлаждали до 0С вольду, добавляли 400 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37С. Аликвоту 100–200 мкл (в73случае плазмидной ДНК) или полный объем (в случае лигазной смеси) трансформационнойсмеси высевали на чашку Петри с твердой средой LB, содержавшей соответствующийантибиотик.
Инкубировали чашку при 37С в течение 16 ч.4.2.1.9. Секвенирование плазмидНуклеотидную последовательность полученной плазмиды контролировали с помощьюавтоматического секвенатора ABI prism 3100-Avant genetic Analyzer (4-х капиллярный). Дляпроведения реакции секвенирования образцы отдавали в Центр Коллективного Пользования«Геном» (Институт молекулярной биологии им.
В.А. Энгельгардта РАН).4.2.1.10 Трансформация клеток H. polymorpha5 мл среды YPD инокулировали колонией необходимого штамма H. polymorhpa иинкубировали при интенсивном перемешивании 200 об/мин в течение 16 ч при 30°С. Затемкультуру клеток разбавляли свежей средой до А600 ~ 0,2 и инкубировали ее приперемешивании еще 4 ч (150–170 об/мин) при 30°С до А600 ~ 0,6–1,0. Затем 1 мл суспензииклеток в среде осаждали мягким центрифугированием 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С,промывали стерильной дистиллированной водой, затем снова осаждали центрифугированием.Осадок клеток ресуспендировали в 25 мкл раствора 0,1 М LiOAc в буферном растворе ТЕ,содержащим 0,5 мг/мл карьерной ДНК, добавляли к клеткам около 1 мкг ДНК (плазмида илиПЦР-фрагмент) и 3 капли стерильного 70% PEG4000 (~30мкл).
Суспензию клеток хорошоперемешивали. Полученную суспензию инкубировали при перемешивании (200 об/мин) при30°С в течение 30 минут. Затем и выдерживали в термостате при 45°С в течение 18 мин. Послеэтого клетки охлаждали 5 мин при -70°С, добавляли 1 мл YPD и инкубировали приперемешивании200об/минвтечение2чпри30°С.Затемклеткиосаждалицентрифугированием в течение 1 мин при 5000 об/мин при 4°С, ресуспендировали в 50 мкл ТЕи высевали на заранее прогретые до 30°С чашки Петри с необходимой селективной средой.Для получения кассеты для трансформации методом ПЦР составляли следующую смесь(такая же смесь использовалась для проверки замены генов на хромосоме методом ПЦР):10х буфер для Taq полимеразы (+KCl)2,5 мкл25 мМ MgCl22,5 мклсмесь dNTP (25 мМ каждого)0,2 мклпраймер 115 пмольпраймер 215 пмоль74плазмида (гДНК)5 нг (150 нг)Taq полимераза0,3 мклН2Одо 25 мклПараметры ПЦР:предварительный прогрев 95С 5 мин,30 циклов:95С 30 с,55С30 с,72С3 мин,в конце программы 72С 10 мин.После проведения ПЦР добавляли 5 мкл 6x буфера для нанесения на агарозный гель ипроводили разделение фрагментов ДНК в 2% агарозном геле (раздел 4.2.6.4.).
ДНК-фрагментнужной длины вырезали из геля и выделяли с помощью набора реагентов для выделения ДНКиз агарозного геля (Thermo Scientific).4.2.1.11 Выделение геномной ДНК H. polymorpha2 мл среды YPD инокулировали клетками необходимого штамма H. polymorpha,инкубировали при интенсивном перемешивании 200 об/мин при 37°С около 12 часов. Клеткиосаждали центрифугированием при 14000 об/мин 5 мин, промывали 500 мкл стерильной воды,осаждали центрифугированием, отбирали воду и ресуспендировали в оставшемся количествеводы. Далее добавляли 200 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении25:24:1, 0,3 г стеклянных шариков и 200 мкл буфера YLB. Интенсивно перемешивали навортексе в течение 2 мин, добавляли 200 мкл раствора TE.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
