Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha (1105689), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Так, согласно модели "счёта белков", ингибирующее действие ScRif1осуществляется после его привлечения на теломеры за счёт взаимодействия с С-концевымдоменом ScRap1. В H. polymorpha два Rap1 белка, тем не менее, ни удаление одного из них, ниудаление С-концевого домена другого, ни совместная мутация не приводят к изменению длинытеломер. С другой стороны, действие ScRif1 на теломеразу опосредовано ScTel1 киназой.63Однако, ни HpTel1, ни привлекающий её на теломеры HpMRX комплекс не участвуют врегуляции длины теломер, как показали наши эксперименты.
Следовательно, HpRif1ингибирует теломеразу, используя другие механизмы.За время изучения механизмов контроля длины теломер S. cerevisiae накопились данные,свидетельствующие о том, что теломерная функция ScRif1 более сложна, чем это представленов модели «счёта белков».
Например, ScRif1 может привлекаться на ДНК независимо от ScRap1.При этом он ингибирует накопление комплекса ScRPA, который в свою очередь задействован впривлечении теломеразы. Это говорит о возможности существования альтернативногорегуляторного пути с участием ScRif1.
Существование такого пути в H. polymorpha могло быобъяснить функцию HpRif1. Другое возможное объяснение может быть связано с ролью Rif1 врепликации. Во многих организмах Rif1 является важным фактором контроля времени«разгорания» ориджинов репликации: в отсутствии Rif1 многие участки генома реплицируютсяраньше положенного [179, 180]. Выдвинута гипотеза о центральной роли времени репликации врегуляции длины теломер делящихся дрожжей S. pombe: короткие теломеры, содержащиеменьше Taz1-Rif1 реплицируются раньше и, как следствие, привлекают большее количествотеломеразы (см. раздел 2.2.3.) [123]. Проверка этих предположений в H. polymorphaпредставляется интересным направлением дальнейших исследований.
С другой стороны,открытие альтернативного механизма действия HpRif1 может расширить репертуар функций,выполняемых гомологами Rif1 в других организмах.Факторы связывания двуцепочечной части теломерной ДНК контролируют длинутеломер во всех изученных организмах. В свете этого полученные нами данные в H. polymorphaнесколько противоречивы. Однако мы не можем исключить того, что остальная часть белкаRap1A (N-концевой или ДНК-связывающий домены) важна для регуляции теломер.
Тем неменее, с уверенностью можно утверждать, что в этом случае механизм действия Rap1A будетдругим, нежели в S. cerevisiae.643.4. ЗаключениеВ представленной работе охарактеризована регуляция длины теломер дрожжейHansenula polymorpha. Результаты проведённых экспериментов показали существование в этомвиде почкующихся дрожжей двух факторов, ограничивающих длину теломер. Первый из них –обратная транскрипция нуклеотида А170 теломеразной РНК H. polymorpha и, как результат,встраивание дополнительного dT нуклеотида. Этот процесс ограничивает длину теломерH. polymorphaзасчётнарушенияспособностипродуктаудлинениятеломеразойрепозиционироваться в начало матричного участка.
Аналогов данному способу регуляцииактивности теломеразы в других организмах не найдено. В литературе описаны примерывключения неверных нуклеотидов на 3’-конец теломерного повтора in vitro [181, 182, 183, 184],однако эти случаи являлись результатом мутаций компонентов теломеразы. Таким образом,данное свойство теломеразы является новым способом контроля длины теломер.Второй важный фактор контроля теломер H. polymorpha – белок Rif1.
Удаление генаэтого белка приводит к удлинению теломер H. polymorpha, следовательно, его функциязаключается в ингибировании работы теломеразы. Участие этого белка в регуляции теломеразыявляется общим, по крайней мере, для двух других эволюционно далёких видов дрожжей –S. cerevisiae и S. pombe. Однако, наши данные говорят о различии механизмов действиягомологов Rif1 в H. polymorpha и S. cerevisiae: удаление генов TEL1, MRE11, RAP1B и удалениеС-концевого домена RAP1A не изменяет длину теломер H. polymorpha. Таким образом,проведённая нами работа позволяет сделать вывод о специфичности регуляторного пути Rap1Rif1/Rif2-MRX/Tel1 для S.
cerevisiae (и очень близких им видов).Выводы, сделанные при изучении регуляции длины теломер H. polymorpha, наглядноиллюстрируют, как мажорный регуляторный путь в одном организме может стать минорнымили вовсе отсутствовать в других, при очевидной консервативности отдельных участниковэтого пути. Это снова подчёркивает важность использования различных модельных организмовдля исследований теломер и теломеразы.654. Материалы и методы4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды,штаммыВ работе были использованы следующие реактивы и препараты:–NaCl, NH4OAc, KCl, (NH4)SO4, MgCl2, CaCl2, MnCl2, Tris, NaOH, ЭДТА, H3BO3,LiCl, цитрат натрия, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, глицерин фирмMerсk, Германия и Helicon, Россия;–ДСН, 1,4-дитиотреитол (ДТТ) фирмы Serva, Германия;–Д-глюкоза, насыщенный буфером ТЕ фенол, NP-40 фирмы Helicon, Россия–уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, фирмыХиммед, Россия;–Triton X-100 фирмы Roth, Германия;–этанол фирмы Ферейн, Россия;–азотистые основания: аденин, урацил; аминокислоты: глицин, лейцин, триптофан,гистидин, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин;глюкоза, стеклянные шарики диаметром 425–600 микрон, НА-агароза, LiOAc, ДТТ, ПМСФ,БСА, поливинилпирролидон, ДНК спермы лосося, формальдегид, ампициллин, канамицин,хлорамфеникол, ДМСО, PIPES, генетицин, протеиназа К, РНаза А фирмы Sigma, Германия;–полиэтиленгликоль 4000 фирмы Fluka, Германия;–бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, Yeast Nitrogen Base w/oaminoacids (YNB), фирмы Difco, США;–легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies, Шотландия;–мембрана HybondN+, [α-32P]dGTP, [γ-32P]ATP фирмы GE Healthcare, США;–олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмами Евроген и Синтол,Россия;–гликоген, набор для очистки ПЦР продуктов, набор реагентов для выделенияплазмидной ДНК , набор для быстрого лигирования ДНК, набор реагентов для выделения ДНКиз агарозного геля; маркеры длины ДНК (1 kb Plus DNA Ladder и Ultra Low Range DNA Ladder),Т4 ДНК лигаза, Taq-полимераза, Pfu-полимераза, полинуклеотид киназа T4, терминальнаятрансфераза, эндонуклеазы рестрикции EcoRI, PmeI, BglII, SalI, XmaI, ClaI, SacII, XbaI, BamHI ифирменные буферные растворы к ним фирмы Thermo Scientific, США;–фильтровальная бумага Whatman 3MM фирмы Whatman Biomerta, Германия;–набор для амплификации G/C-богатых фрагментов ДНК GC-RICH PCR Systemфирмы Roche, Франция;66–набор для проведения мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kitфирмы Agilent Technologies, США.–фиколл 400 фирмы Pharmacia, Швеция.–штаммы daduA и DL1-l были любезно предоставлены Михаилом Агафоновым(Москва), штамм ΔHpTER был любезно предоставлен Еленой Смекаловой (Москва);–плазмида pKAM_RNA была любезно предоставлена Еленой Смекаловой(Москва), плазмиды pCCUR1 и pCHLX были любезно предоставлены Михаилом Агафоновым(Москва);Таблица 4.1.
Растворы, использовавшиеся в работе.Название раствораСостав растворасреда LB,твердая среда LBSOB1 % бакто-триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 1% NaCl (1,5%бакто-агар для твердой среды)2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 8,55 мМ NaCl, 2,5мМ KCl, 0,5 мМ MgCl22% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 8,55 мМ NaCl, 2,5мМ KCl, 0,5 мМ MgCl2, 20 мМ глюкоза10 мМ PIPES, 15 мМ CaCl2, 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl2 (рН 6,7)SOCTBсреда YPD, твердаясредаYPD(наглюкозе)среда SС,твердая среда SС (наглюкозе)среда SС-LEU,твердая среда SС-Trp(на глюкозе)2% бакто-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза (2%бакто-агар для твердой среды)0,17% YNB, 0,5% (NH4)SO4, 2% глюкоза, 0,01% аденин, 0,02%урацил, 0,01% лейцин, 0,01% триптофан, 0,005% гистидин,0,02% треонин, 0,002% аргинин, 0,003% изолейцин, 0,003%лизин, 0,002% метионин, 0,005% фенилаланин, 0,003%тирозин, 0,015% валин (2% бакто-агар для твердой среды, 250мкл 2М NaOH на 200 мл твердой среды).среда SС без добавления лейцинасреда SС-URA,среда SС без добавления урацилатвердая среда SС-Ura(на глюкозе)10х буфер ТА20 мM Tris-ацетат (pH 7.5), 50 мM NaCl и 2 мM MgCl22xSSCбуфергибридизации0,3 M NaCl, 0,03 M цитрат натрия, pH 7.0для 6xSSC, 0,5% ДСН, 5х раствор Денхардта, 100 мкг/мл ДНКспермы лосося67100хДенхардтаChIPLysisраствор 2% БСА, 2% фиколл 400, 2% поливинилпирролидонТЕ50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 140 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 1%TritonX-100, 0,1% ДСН, 0,5 мМ ПМСФ50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 500 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 1%TritonX-100, 0,1% ДСН, 0,5 мМ ПМСФ10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,25 LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% ДСН,1 мМ ЭДТА10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТАTES10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 1% ДСНTE0,67S10 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,67% ДСН1хTBE0,1 М Tris-HCl (рН 8,3), 0,1 M H3BO3, 2 мM ЭДТА10xTBE1 М Tris-HCl (рН 8,3), 1 M H3BO3, 20 мM ЭДТАагарозные гели1-2% агароза в буфере 1хTBE, 0,05 мкг/мл бромистый этидийChIPLysis500ChIPWash6хбуфернанесенияагарозный гельбуфер YLBдля 10 мМ Tris, 60 мМ ЭДТА (рН 7,6), 0,03% ксиленцианол, 0,03 %на бромфеноловый синий, 60% глицерин1xTE, 100 мМ, 2% Triton X-100, 1% ДСНТаблица 4.2.
ДНК-олигонуклеотиды, использовавшиеся в работе.НазваниеолигонуклеотидаНуклеотидная последовательностьPBoli7335′-GCGTACGACTCACTGTAGATNNNNN-3′-O(CH2)2CH2OHPBoli7495′р-ATCTACAGTGAGTCGTACGCAA-3′-биотинS125'-AAGCGGCAGAGTTGGTTTCAGGATGC-3'PBoli7455'-GCGTACGACTCACTGTAGAT-3'24f5'-CTTCACTATGCGGTGTTCTCGCCACCCCGCCACCC-3'24r5'-GGGTGGCGGGGTGGCGAGAACACCGCATAGTGAAG-3'23f5'-CTTCACTATGCGGTGTTCCCGCCACCCCGCCACCC-3'23r5'-GGGTGGCGGGGTGGCGGGAACACCGCATAGTGAAG-3'25f5'-CTTCACTATGCGGTGTTCGCGCCACCCCGCCACCC-3'25r5'-GGGTGGCGGGGTGGCGCGAACACCGCATAGTGAAG-3'34f5'-CTTCACTATGCGGTGTTCCAGCCACCCCGCCACCCC-3'34r5'-GGGGTGGCGGGGTGGCTGGAACACCGCATAGTGAAG-3'38f5'-GGTGTTCACGCCACCACGCCACCCCTCGTCAAC-3'6838r5'-GTTGACGAGGGGTGGCGTGGTGGCGTGAACACC-3'G45'-GGGTGGCGGGGTGGCGGGGTGGCGGGGTGGCG-3'C45'-CGCCACCCCGCCACCCCGCCACCCCGCCACCC-3'U3f5'- AAAAGATCTAGAGCTAAGTTTGTTGGAG-3'5'-U3rAAAGAATTCGAGCTCGTTTAAACTACAACGAAGCACATCAACTGG -3'5Rap1BHAf5'-ATTTGTCGACGAACCTACGACGTAC-3'5Rap1BHAr5'-AAACCCGGGCTGTTTTATCTTGCGCATATTCTCCAG-3'5Rap1АΔCf5'-AAAAGTCGACCGAAGAGGACTACGAGCTATG-3'5Rap1АΔCr5'-AAACCCGGGATCGTCGTTCAGAGCCTTGATCTC-3'3Rap1BHAf5'-AAAAGTTTAAACTCGTTCGTCCTCGTCTAGGTC-3'3Rap1BHAr5'-AAATCGATGAATCCGCTTTCTCGCTGCTAC-3'3Rap1АΔCf5'-AAAAGTTTAAACAATCCGTGAGTTTGGAGCATCCAC-3'3Rap1АΔCr5'-AAATCGATCGAGGCTTTGGTGTTGGTGTC-3'5Rap1Bf5'-AACCGCGGCCTCAATCTCCTGCTCGATGC-3'5Rap1Br5'-AAATCTAGAGTGCTGCGAGTGTGTTTATCGG-3'5Rif1f5'-AACCGCGGACCAGGTCATCTACAGAGACGAG-3'5Rif1r5'-AAATCTAGACGGGTGTGTGATTCTGCAAACC-3'rif1r5'-GATGCGCAGGTGGCGTTGTCC-3'5Tel1f5'-AACCGCGGCTGGACCTGTTGGTAAGGAGTG-3'5Tel1r5'-AAATCTAGATCTCGCTCAGCTGGCGATAC-3'5Mre11f5'-AACCGCGGTGAGCAATCTGCGAATAGAGCAGC-3'5Mre11r5'-AAATCTAGACTGGCCCTGATTCTATGTCCG-3'3Rap1Bf5'-AAGGATCCTCGTTCGTCCTCGTCTAGGTC-3'3Rap1Br5'-AAGAATTCGAATCCGCTTTCTCGCTGCTAC-3'3Rif1f5'-AAGGATCCGTTGGAATCTCGCCGACTCAGG-3'3Rif1r5'-AAGAATTCGTCACCAGTTCTTCCAGCTTGACC-3'3Tel1f5'-AAGGATCCGTTCGTGCTTCTGCTGCGTG-3'3Tel1r5'-AAGAATTCGCCACATTCTGTGCGTCTTTCAG-3'3Mre11f5'-AAGGATCCAAACCGACCAGTCTGTTCGG-3'3Mre11r5'-AAGAATTCCCTCTCCATCCACTTGTC-3'Sub7f5'-TGCTGGGTGGTAAGAGCTAGG-3'Sub7r5'-CTGAAACCAACTCTGCCGCTTC-3'697100f5'-GTGCTGGTCTCCTTCAGCTTC-3'7100r5'-CCTCCGATATCAAGGAGCTTGTG-3'Таблица 4.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
