Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha (1105689), страница 11
Текст из файла (страница 11)
С-концевой доменSACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB657648685504490ISN-------SLPF---EYPHEIAEAIRSDFSN--------------ED-IYDNIDPDTISFPPKIATTD---LFLPLFFLESNNSGNNNNLPF---EYSPEIAEAIRNDFDN--------------EGKEFDNIDPDTIKFPPEIATID---LFLPIFFLES-------TLPF---EYPQEIADAIRNDFTN--------------EEEEYDNIDPNSIKFPPPIASIE---LFLPTFFMESHQN-QAPDIPF---EYTQELAESIRNNFTM--------------EETQFDNINPDEIPFPPQIATTD---LFMPEFFAETQQE---EQARS---LYADDVAERIRHQVAL--------------EHEEYDNYDFDSIPFPPKLADND--DFFDHTFF--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------469 FDAL--------P----------SIETEGNFSF--------------EE--LKKEDPEPLKNKSLINVEETCAQIEQIFG374 ----------SIAMAAQQANQDLVTAFKN-FRQEEQDGPPAKRAKRDQRSSSANIDPAIEGMQPPLEFVD---EPTTYF-SACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB709708738563548SACCESACCASACDAASGOSKLULACANALCANDUHANPOAHANPOB775774804629614HFGSTRQFM---------DKLHEVISGDYEPSQAEKLVQDLCDETGIRKNFSTSILTCLSGDLMVFPRYFLNMFK----QFGSTRNFL---------EKVENVIKRDYEPSQAEKLVEDLCDEAGVRRGFSTSILTALSGDLMIFPRYFLNMFK----QMGSTREFM---------LKVNEVITRDYEPSQAEKLVQDLSDEAGVRRTFSTSILTALSGDLMVFPRYFLTMFK----HFATTRDFL---------NKVHEIVNRTYHTSQAEKLVEDLRDECGIRKAFSTSILTALSGDLMVLPRYFLCAFR----NFRSTKEFI---------QKLEEIITREYDESQADVLVHDLDVECGIRKKYATSVLTALTGDISLFPRYILTSFK------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------515 SFGSSI-------------------------TTSFELFKVMNEKVGLSMGWLTYWFDCSCGHLNLFMAAILNYIR----439 --SDPR-FALSLKNEGPPIDLADVLP------RKESFLEQLDKTLDPQVTVTTKTLFSQLASLGIKEYYIIFLFHRCNSR--------------DNVNPPPNVPGIWTHDDDESLKSNDQEQIRKLVKKHGTGRM----EMRKRFFEKDLL--------------NNVNPPLNVPGIWTHEDDAMLSSNDSEDLRHLEKKHGAARI----AIRRRFVERDLV--------------DNINPPPNVPGIWTREDDEMLRSNKGEDLQALEKKHGVGRI----EIRRKFVERDLV--------------YSANPPMNVPGIWTKEDDEMLKNNSDEDMKLLIKKHGSGRI----EMRKRFHQNDLV--------------YGVHLPQNVPGIWTKEDDVILRSKNPDGMKMLEKKHGIARM----QMRIRFQENNLV--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------565 --------------NDELILSNYPGFWTSEHDRMLKEE--DKISDLIKLHGLESV----TKRREALYG--E510 RNLVLDCIKNYLDTNGKELLVQKPGVWSNKALEWLGKNDSHLNSLLELYHGEHDYRTQLENMRKIK----QРисунок 3.12.
Множественное выравнивание гомологов Rap1. Последовательностигомологов Rap1 были выравнены при помощи программы T-COFFEE и размечены при помощипрограммы BoxShade. На рисунке представлены выравнивания отдельных доменов: А – BRCTдомен, Б – дуплицированный MYB домен, В – С-концевой домен. Чёрным выделеныаминокислоты, идентичные более чем в 50% последовательностей, серым – аминокислоты,схожие более чем в 50% последовательностей. Сокращённые названия организмов: SACCE –Saccharomyces cerevisiae, SACCA – Saccharomyces castellii, SACDA – Saccharomyces dairenensis,ASGOS – Ashbya gossypii, KLULA – Kluyveromyces lactis, CANAL – Candida albicans, CANDU –Candida dubliniensis, HANPO (A и B) – Hansenula polymorpha (белки Rap1A и Rap1B,соответственно).58Для того чтобы понять, какой из гомологов белков Rap1 связывает теломеры вH.
polymorpha,мыполучилиштамм,экспрессирующийбелокRap1Bслитыйсгемагглютининовым тагом (НА таг). Для этого мы заменили на хромосоме ген RAP1B намодифицированный ген (RAP1B-HA). К сожалению, нам не удалось получить аналогичныйштамм с тагированным Rap1А. Это может быть связано с тем, что наличие тага в данномположении нарушает функцию Rap1А, которая необходима для жизни клетки.
Rap1 являетсякритически важным для жизнедеятельности S. cerevisiae – делеция гена RAP1 в S. cerevisiaeявляется летальной. Однако удаление С-концевого домена хорошо переносится клетками S.cerevisiae. Поэтому мы получили штамм, экспрессирующий мутантный Rap1А, в котором Сконцевой домен белка заменён на НА таг (путём соответствующей замены генов на хромосоме).Для связывания с ДНК С-концевой домен Rap1 не нужен, поэтому полученный тагированныйвариант белка без С-домена также поможет нам ответить на вопрос о взаимодействии Rap1А стеломерами H.
polymorpha. Замену генов на хромосоме в полученных штаммах подтверждалиПЦР анализом согласно схеме, изображённой на рисунке 3.13. Наличие продуктов нужнойдлины говорит об успешной замене генов.Рисунок 3.13. Создание штаммов Rap1A-ΔC-HA и Rap1B-HA. А – схема ПЦР анализагеномной ДНК. Стрелки обозначают праймеры, использованные в ПЦР реакции. В таблицеприведены ожидаемые длины ПЦР продуктов.
Б – продукты ПЦР с геномной ДНК штаммовWT и штаммов с тагированными Rap1 белками, разделенные в агарозном геле. Длины(мажорных) ПЦР продуктов в дорожках соответствуют ожидаемым. М – маркер.59ПроверкуассоциацииRap1белковстеломерамиосуществлялиметодомиммунопреципитации хроматина по схеме, изображённой на рисунке 3.14А. Клетки штаммовRap1A-ΔC-HA, Rap1B-HA и дикого типа обрабатывали формальдегидом для фиксациивзаимодействий белок-ДНК. Затем из фиксированных клеток получали экстракты ивоздействовали на них ультразвуком для фрагментации хроматина.
При этом получалисьфрагменты ДНК длиной около 500 пн. Из полученных экстрактов выделяли тагированныебелки при помощи аффинной хроматографии с использованием НА-агарозы (агароза,ковалентно модифицированная антителами к НА тагу). Экстракт, полученный из штаммадикого типа (daduA, не имеющий тагированных белков), использовали для оценки количестваДНК, выделяющейся за счет неспецифических взаимодействий. Наличие теломер всовыделяющейся с тагированными белками ДНК проверяли ПЦР анализом с использованиемпраймеров 1 (sub7f, sub7r), при этом амплифицируется фрагмент ДНК из субтеломернойобласти хромосомы VII длиной около 200 пн, отстоящий от конца хромосомы не более, чем на200 пн.
В качестве контроля специфичности проводили ПЦР с праймерами 2 (7100f, 7100r),которые амплифицируют фрагмент ДНК (длиной около 200 пн), отстоящий от концахромосомы на 100 000 пн. Результаты ПЦР анализа приведены на рисунке 3.14Б. ОбогащениеПЦР продукта праймеров 1 в случае штаммов Rap1A-ΔC-HA и Rap1B-HA (по сравнению соштаммом дикого типа) свидетельствует о взаимодействии белков Rap1A и Rap1B с теломернойДНК. О специфичности этого взаимодействия свидетельствует отсутствие аналогичногообогащения ПЦР продукта праймеров 2.60Рисунок3.14.ОценкаассоциацииRap1белковстеломерамиметодомиммунопреципитации хроматина.
А – схема эксперимента. Б – схема и результат ПЦР анализа.Таким образом, оба гомолога Rap1 взаимодействуют с теломерами H. polymorpha invivo. Проведённый эксперимент не позволяет утверждать, что теломерная локализация обоихбелков осуществляется за счёт прямого взаимодействия с ДНК. Тем не менее, присутствие вRap1A и Rap1B дуплицированного MYB домена свидетельствует в пользу именно прямоговзаимодействия.Далее мы решили проверить участие белков Rap1A, Rap1B, Rif1, Mre11 и Tel1 врегуляции длины теломер H.
polymorpha. Для этой цели мы создали штаммы с делециями геновэтих белков ("нокаутные" штаммы) путём замены соответствующих генов на хромосоме на генLEU2. Получить штамм с делецией гена RAP1A нам не удалось, что согласуется снеобходимостью функции Rap1A для жизни клетки. Для оценки влияния Rap1A на длинутеломер мы использовали полученный ранее штамм, в котором С-концевой домен заменён наНА таг.
Ведь именно С-концевой домен должен играть ключевую роль в регуляции длинытеломер. Поскольку Rap1А и Rap1B могут иметь сходную функцию, мы также создали штамм,в котором одновременно удалены ген RAP1B и С-концевой домен Rap1A (штамм RАΔCΔRB).Замену генов на хромосоме в полученных штаммах подтверждали ПЦР анализом согласносхеме, изображённой на рисунке 3.15. Наличие продуктов нужной длины говорит об успешнойзамене генов.61Рисунок 3.15.
Создание "нокаутных" штаммов. А – схема ПЦР анализа геномной ДНК.Стрелки обозначают праймеры, использованные в ПЦР реакции. Исключением является генRIF1 – праймеры подобраны таким образом, что при правильной замене генов продукта ПЦР недолжно получаться (см. таблицу). В таблице приведены ожидаемые длины ПЦР продуктов.гДНК – геномная ДНК. Б – разделенные в агарозном геле продукты ПЦР с геномной ДНКштаммов WT, штаммов с делециями генов RIF1, TEL1, MRE11 и штамма RАΔCΔRB (#1 и #2 –два независимо полученных штамма). Длины (мажорных) ПЦР продуктов в дорожкахсоответствуют ожидаемым. Результаты ПЦР анализа с геномной ДНК штамма ΔrapBаналогичны таковым штамма RАΔCΔRB, поэтому не приведены на рисунке.
М – маркер.Полученные штаммы культивировали в течение 50 поколений. Из клеток послекультивирования выделяли геномную ДНК и измеряли длину теломер при помощи«теломерного» ПЦР. Результаты представлены на рисунке 3.16А. Оказалось, что ни удалениеRAP1B, ни удаление С-концевого домена Rap1A, ни их совместная мутация не приводит кизменению длины теломер. Более того, длина теломер в штаммах Δtel1 и Δmre11 также неотличается от длины в штамме дикого типа.
Только удаление RIF1 приводит к значительномуудлинению теломер.62Рисунок 3.16. Длина теломер в нокаутных штаммах и штамме дикого типа (WT). А –результаты «теломерного» ПЦР. На рисунке не приведены результаты «теломерного» ПЦР дляштаммов Rap1A-ΔC-HA и Δrap1B, поскольку результат не отличается от такового для штаммаRАΔCΔRB. #1 и #2 – два независимо полученных штамма RАΔCΔRB. М – маркер. Б –сравнение длины теломер в штаммах S. cerevisiae и H. polymorpha с делециями указанныхгенов.
«+» – теломеры в штамме с соответствующей мутацией длиннее, чем в штамме дикоготипа, «-» – теломеры короче, чем в штамме дикого типа, «wt» – теломеры такой же длины, как вштамме дикого типа.Таким образом, единственным (из проанализированных гомологов S. cerevisiae) белком,регулирующим теломеры H. polymorpha, оказался белок Rif1 (Рисунок 3.16Б). Это несколькоудивительно, ведь выбранные нами белки S. cerevisiae являются участниками одногорегуляторного пути.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
