Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha (1105689), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Центрифугировали при 14000 об/минв течение 5 мин, отбирали водную фазу, добавляли к ней 1 мл этанола (96%), перемешивалипереворачиванием. Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин, отбирали воднуюфазу, осадок растворяли в 400 мкл раствора TE, добавляли 3 мкл рибонуклеазы А (10 мг/мл),инкубировали при 37°С в течение 5 мин.
Затем к смеси добавляли 10 мкл 4 М NH4OAc, 1 млэтанола. Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин, отбирали супернатант, осадоксушили на воздухе при 44-45°С, растворяли в 30 мкл раствора TE. Концентрация выделеннойДНК составляла ~ 0,5 мкг/мкл.754.2.2. Определение последовательностей теломер H. polymorphaВ данном эксперименте использовали геномную ДНК, выделенную из клеток штамма H.polymorpha дикого типа DL1-l.«Теломерный» ПЦР.Формирование адаптера. Адаптер формировали из ДНК-олигонуклеотидов PBoli733 иPBoli749 в буфере TA. Составляли следующую смесь:10х буфер ТА5 мклPBoli7335 пмольPBoli7495 пмольН2Одо 50 мклПолученный раствор нагревали при 95°С, в течение 1 мин, далее выдерживали при 75°С5 минут и оставляли медленно охлаждаться до комнатной температуры.Лигирование адаптера к геномной ДНК. Дуплекс лигировался к выделенной геномнойДНК с помощью набора для быстрого лигирования ДНК (Rapid DNA ligation kit, ThermoScientific).
Реакционная смесь:5х буфер2 мклгДНК1 мкг«адаптер»2,5 мклТ4 ДНК лигазаН2О0,5 мклдо 10 мклПолученный раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, далеевыдерживали при 65°С 10 минут.ПЦР. ПЦР проводился с помощью реагентов набора для амплификации G/С-богатыхучастков GC-RICH PCR System (Roche).В пробирке 0,2 мл составляли следующую смесь:5х буфер2,5 мкл5М раствор GC resolution solution2,5 мклсмесь dNTP (25 мМ каждого)0,2 мклпраймер S1215 пмоль76праймер PBoli74515 пмольДНК (гДНК+адаптер)2 мклДНК полимераза1 мклН2Одо 25 мклПараметры ПЦР:30 циклов:предварительный прогрев 95С 5 мин,95С 30 с,56С 30 с,72С 30 с,в конце программы 72С 10 мин.Для анализа длины теломер после проведения ПЦР в смесь добавляли 5 мкл 6x буферадля нанесения на агарозный гель, проводили разделение фрагментов ДНК в 2% агарозном геле.В качестве маркера длины ДНК использовали Ultra Low Range DNA Ladder (Thermo Scientific).Секвенирование ПЦР продуктов.Для глубокого секвенирования теломер после разделения в агарозном геле зону,соответствующую ПЦР продукту теломер (около 200 пн) вырезали из геля.
Затем выделялиДНК с использованием набора для выделения ДНК из геля (Thermo Scientific). Для анализаполучали ДНК в количестве 500 нг (в виде водного раствора с концентрацией 10 нг/мкл).Концентрацию измеряли при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000. Севенированиепроводилось на геномном секвенаторе Roche GS FLX по протоколу Titanium в лабораторииНиколая Викторовича Равина (Центр «Биоинженерия» РАН). Из ридов, прошедших контролькачества, выбирались те, которые содержали последовательности праймеров S12 и/илиPBoli745. В результате получилось 5317 ридов, эти последовательности были размещены в базеданных SRA (NCBI) под номером SRX316596.4.2.3.
Получение штаммов, экспрессирующих мутантные формы HpTER4.2.3.1. Мутагенез матричного участка HpTERМутагенез проводили на плазмиде pKAM556_RNA, представляющей собой шаттлвектор pKAM556 (устойчивость к канамицину) [185], содержащий ген теломеразной РНК H.polymorpha. Мутагенез проводили при помощи набора QuikChange II Site-Directed MutagenesisKit (Agilent Technologies). В пробирке 0,2 мл составляли следующую смесь:7710х буфер2,5 мклQuickchange solution1,5 мклсмесь dNTP (10 мМ каждого)0,5 мклпраймер 110 пмольпраймер 210 пмольплазмида5 нгДНК полимераза0,3 мклН2Одо 25 мклПараметры ПЦР:30 циклов:предварительный прогрев 95С 1 мин,95С 30 с,55С 60 с,68С 4 мин,в конце программы 68С 10 мин.Затем добавляли 0,5 мкл эндонуклеазы рестрикции DpnI, инкубировали 1 час при 37 С ипроводили трансформацию в E.
coli. Выделяли из полученных колоний плазмиды и проверялиправильность мутации секвенированием.В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды:мутация А170U – 24f/24r, А170С – 23f/23r, А170G – 25f25r, СА170АС – 34f/34r, С178А –38f/38r.4.2.3.2. Создание штаммовПолученными плазмидами трансформировали штамм ΔHpTER.
Для селекции послетрансформации клетки высевали на среду 0,7xYPD + 120 мкг/мл генетицина.4.2.4. Саузерн блот анализ концевых рестрикционных фрагментов4.2.4.1. Получение и разделение рестрикционных фрагментовИз необходимого штамма H. polymorpha выделяли 10 мкг геномной ДНК иобрабатывали её эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Для этого составляли следующую смесь:10х буфер EcoRI2,5 мкл78гДНК10 мкгEcoRI3 мклН2Одо 25 мклИнкубировали смесь 16 часов при 37 °С, затем 20 мин при 65 °С. Добавляли 5 мклбуфера для нанесения на агарозный гель.
Образцы наносили в 1,5% агарозный гель и проводилиэлектрофорез при 100мА в течение 4 часов. Гель фотографировали при помощи камеры с УФлампой (ChemiDoc, Bio-Rad) для визуализации маркера длины ДНК (здесь использовали 1 kbPlus DNA Ladder).4.2.4.2. Перенос ДНК на нитроцеллюлозную мембрануПосле электрофореза обрезали лишние участки геля (не содержащие ДНК) и измерялиоставшуюся часть.
Инкубировали обрезанный гель 15 мин при умеренном перемешивании в0,25 М HCl, ополаскивали дистиллированной водой, инкубировали в 0,4 М NaOH 30 мин принебольшом перемешивании. Далее осуществляли перенос ДНК на мембрану HybondN+(Amersham). Для этого собирали следующую конструкцию. В ванночку наливали 0,4 М NaOH иклали подложку. На подложку клали 2 куска фильтровальной бумаги Whatman 3ММ,смоченной раствором 0,4 М NaOH, чтобы концы бумаги были погружены в щёлочь в ванночке.Сверху клали гель вверх дном, на него – мембрану, смоченную раствором 0,4 М NaOH, недопуская образования пузырьков воздуха между гелем и мембраной. На мембрану клали трилиста фильтровальной бумаги Whatman 3ММ, смоченных раствором 0,4 М NaOH.
На мембранупомещали три листа фильтровальной бумаги Whatman 3ММ, смоченной раствором 0,4 МNaOH, сверху – стопку фильтровальной бумаги (высотой 5 см), сверху – груз (около 300 г).Полученный «сэндвич» оставляли на 12-16 часов.4.2.4.3. Приготовление зондов для гибридизацииДля гибридизации использовали два зонда. Первый зонд – в олигонуклеотид G4,меченный добавлением [α-32P]dGTP на 3’-конец терминальной трансферазой (Thermo Scientific;и олигонуклеотид С4, меченный по 5’-концу радиоактивным фосфатом (32P) при помощи Т4полинуклеотид киназы (Thermo Scientific).Для мечения G4 составляли смесь из компонентов набора для терминальнойтрансферазы:G41 нмоль795x буфер10 мкл[α-32P]dGTP800 МБкH2Oдо 50 мклтерминальная трансфераза1 мклИнкубировали смесь 15 мин при 37 °С, затем добавляли 2 мкл 0,5 М ЭДТА иинкубировали смесь 10 мин при 75 °С.Для мечения С4 составляли смесь из компонентов набора для Т4 полинуклеотид киназы:С41 нмоль10x буфер А5 мкл[γ-32P]ATP800 МБкH2Oдо 50 мклТ4 полинуклеотид киназа1 мклИнкубировали смесь 20 мин при 37 °С, затем 10 мин при 75 °С.4.2.4.4.
Гибридизация мембраны с зондамиМетодика представляет собой модифицированный протокол, описанный в (137).Вкратце, мембрану после переноса промывали в буфере 2xSSC, запекали в течение 1 часа при80 °С под вакуумом, промывали буфером 6xSSC. Далее проводили прегибридизацию в буфередля гибридизации в течение 1 часа при 68 °С. Объём буфера выбирали из расчёта 0,2 мл накаждый квадратный сантиметр мембраны.
Далее проводили гибридизацию с зондами(концентрация – 10 пмоль/мл) в буфере для гибридизации (+0,01 М ЭДТА) в течение 12-16часов при 68 °С. Затем мембрану промывали буфером 2xSSC+0,25% ДСН трижды по 15 минпри 68 °С. Мембрану подсушивали и анализировали с помощью электронной авторадиографиина приборе Typhoon FLA 9500.4.2.5. Получение штаммов Rap1A-ΔC-HA и Rap1B-HA4.2.5.1.
Плазмида pFA6a-3HA-HpURA3Для создания штаммов с тагированными белками использовалась плазмида pFA6a-3HAHpURA3. Эта плазмида был получена из плазмиды pFA6a-3HA-kanMX6 (устойчивость кампициллину) [186] путём клонирования в одну стадию. В процессе клонирования ген80устойчивости к генетицину (kanMX6) в плазмиде pFA6a-3HA-kanMX6 заменяли на генHpURA3, придающий клеткам H. polymorpha способность расти на среде без урацила, посайтам эндонуклеаз рестрикции PmeI и BglII. Ген HpURA3 получали методом ПЦР спраймерами U3f и U3r, в качестве матрицы использовали плазмиду pCCUR1 (устойчивость кхлорамфениколу).4.2.5.2. Получение кассет для трансформацииСначалаизплазмидыpFA6a-3HA-HpURA3получалиплазмиды,содержащиенеобходимые кассеты для трансформации, путём клонирования в две стадии (Рисунок 4.1).«ген» – участок соответствующего гена длиной около 500 пн, кодирующий последниеаминокислоты белка.
«НА» – фрагмент ДНК, кодирующий последовательность YPYDVPDYA,повторённую три раза. «ген 3’» – участок длиной около 500 пн, расположенный в геноме послестоп-кодона соответствующего гена. На первой стадии вставляли «ген» в плазмиду pFA6a3HA-HpURA3 по сайтам SalI и XmaI. «ген» получали методом ПЦР с праймерами5Rap1BHAf/5Rap1BHAr (для штамма Rap1B-HA) или 5Rap1АΔCf/5Rap1АΔCr (для штаммаRap1A-ΔC-HA), используя гДНК H. polymorpha в качестве матрицы. На второй стадиивполучившуюся плазмиду вставляли «ген 3’» по сайтам PmeI и ClaI.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
