Регуляция длины теломер дрожжей Hansenula polymorpha (1105689), страница 15
Текст из файла (страница 15)
«ген 3’» получали методомПЦРспраймерами3Rap1BHAf/3Rap1BHAr(дляштаммаRap1B-HA)или3Rap1АΔCf/3Rap1АΔCr (для штамма Rap1A-ΔC-HA), используя гДНК H. polymorpha (изштамма DL1-l) в качестве матрицы.Рисунок 4.1. Схема получения плазмид с кассетами для трансформации из pFA6a-3HAHpURA3.81КассетыдлятрансформацииполучалиметодомПЦРспраймерами5Rap1BHAf/3Rap1BHAr (для штамма Rap1B-HA) или 5Rap1АΔCf/3Rap1АΔCr (для штаммаRap1A-ΔC-HA), используя соответствующие плазмиды в качестве матрицы. Состав ПЦР смесии параметры ПЦР описаны в разделе 4.2.1.10.4.2.5.3.
Получение штаммов, отбор клоновПолученными кассетами трансформировали штамм daduA. Для селекции послетрансформации клетки высевали на среду, не содержащую урацил (SC-URA). Замену генов нахромосоме в колониях после трансформации подтверждали методом ПЦР с праймерами5Rap1BHAf/3Rap1BHAr (для штамма Rap1B-HA) или 5Rap1АΔCf/3Rap1АΔCr (для штаммаRap1A-ΔC-HA), используя гДНК из колоний в качестве матрицы. Состав ПЦР смеси ипараметры ПЦР описаны в разделе 4.2.1.10.4.2.6.
Получение «нокаутных» штаммов4.2.6.1. Получение кассет для трансформацииСначала из плазмиды pCHLX (устойчивость к хлорамфениколу) [187] получалиплазмиды, содержащие необходимые кассеты для трансформации, путём клонирования в двестадии (Рисунок 4.2). «ген 5’» – участок соответствующего гена длиной около 500 пн,расположенный в геноме перед старт-кодоном соответствующего гена. «HpLEU2» – генHpLEU2, позволяющий клеткам расти на среде без лейцина. «ген 3’» – участок длиной около500 пн, расположенный в геноме после стоп-кодона соответствующего гена. На первой стадиивставляли «ген 5’» в плазмиду pCHLX по сайтам SacII и XbaI.
«ген 5’» получали методом ПЦРс праймерами 5Rap1Bf/5Rap1Br (для штамма Δrap1B), 5Rif1f/5Rif1r (для штамма Δrif1),5Tel1f/5Tel1r (для штамма Δtel1) и 5Mre11f/5Mre11r (для штамма Δmre11), используя гДНК H.polymorpha в качестве матрицы. На второй стадии в получившуюся плазмиду вставляли «ген3’» по сайтам BamHI и EcoRI. «ген 3’» получали методом ПЦР с праймерами 3Rap1Bf/3Rap1Br(для штамма Δrap1B), 3Rif1f/3Rif1r (для штамма Δrif1), 3Tel1f/3Tel1r (для штамма Δtel1) и3Mre11f/3Mre11r (для штамма Δmre11), используя гДНК H. polymorpha в качестве матрицы.82Рисунок 4.2.
Схема получения плазмид с кассетами для трансформации из pCHLX.Кассеты для трансформации получали методом ПЦР с праймерами 5Rap1Bf/3Rap1Br(для штамма Δrap1B), 5Rif1f/3Rif1r (для штамма Δrif1), 5Tel1f/3Tel1r (для штамма Δtel1) и5Mre11f/3Mre11r (для штамма Δmre11), используя соответствующие плазмиды в качествематрицы. Состав ПЦР смеси и параметры ПЦР описаны в разделе 4.2.1.10.4.2.6.2. Получение штаммов, отбор клонов.Полученными кассетами трансформировали штамм daduA.
Для селекции послетрансформации клетки высевали на среду, не содержащую лейцин (SC-LEU). Замену генов нахромосоме в колониях после трансформации подтверждали методом ПЦР с праймерами5Rap1Bf/3Rap1Br (для штамма Δrap1B), 5Rif1f/rif1r (для штамма Δrif1), 5Tel1f/3Tel1r (дляштамма Δtel1) и 5Mre11f/3Mre11r (для штамма Δmre11), используя гДНК из колоний в качествематрицы. Состав ПЦР смеси и параметры ПЦР описаны в разделе 4.2.1.10.4.2.7. Иммунопреципитация хроматина5 мл среды YPD инокулировали колонией соответствующего штамма и инкубировалипри интенсивном перемешивании 200 об/мин в течение 16 ч при 30°С.
Затем культуру клетокразбавляли свежей средой до А600 ~ 0,2 и инкубировали ее при перемешивании еще 3 ч (150–170 об/мин) при 30°С до А600 ~ 1,0. К 50 мл полученной культуры клеток добавляли по каплям1,35 мл 37% формальдегида, инкубировали 1 час при перемешивании на комнатной83температуре. Затем добавляли 2,5 мл 2,5 М глицина и инкубировали при перемешивании ещё 5минут. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 5000 об/мин идважды промывали водой.
Полученный осадок клеток замораживали в жидком азоте имеханически перетирали с помощью дисмембратора (Mikro-DismembratorU, фирмы Sartorius,Россия). Перетертый порошок клеток размораживали во льду 1 мл холодного буфера ChIPLysis.Далее проводили разрушение хроматина во льду ультразвуком при максимальной мощности (3подхода по 11 секунд, с перерывами в 2 минуты), в результате получались фрагменты ДНКоколо 500 пн. Центрифугировали лизат в течене 15 минут при 4˚С при 14000 rpm. 0,9 млполученного экстракта инкубировали с 30 мкл НА-агарозы (предварительно уравновешенной вChIPLysis буфере) 2 часа при +4°С. Промывали 2×1 мл ChIPLysis буфера, 1×1 мл ChIPLysis500буфера, 2×1 мл ChIPWash буфера и 1×1 мл ТЕ буфера.
Далее элюировали инкубацией смолыпри 65°С в течении 15 мин в 110 мкл TES буфера, затем промывали смолу 150 мкл TE0,67Sбуфером (объединяли эти две фракции). 250 мкл фракций инкубировали при при 68°С втечении 16 часов для разрушения формальдегидных сшивок. Затем разбавляли в 2 раза буферомТЕ и обрабатывали протеиназой К (к 500 мкл полученного раствора добавляли 5 мклпротеиназы К с концентрацией 20 мг/мл) в течение 2 часов при 37˚С.
Добавляли 5 мкггликогена и 55 мкл 4 М LiCl, экстрагировали белки равным объемом фенола, затем смесьюхлороформ:изоамиловый спирт (24:1), затем осаждали ДНК добавлением 1 мл этанола.Центрифугировали в течене 15 минут при 4˚С при 14000 rpm. Полученный осадок сушили навоздухе, растворяли в 25 мкл ТЕ буфера (содержащем 10 мкг РНазы А) и инкубировали 1 часпри 37°С. Проводили ПЦР анализ полученных образцов. В качестве праймеров использовалиSub7f/Sub7r (для определения теломер в выделенной ДНК) и 7100f/7100r (для определениянеспецифической ДНК).В пробирке 0,2 мл составляли следующую смесь:10х буфер для Taq полимеразы (+KCl)2,5 мкл25 мМ MgCl22,5 мклсмесь dNTP (25 мМ каждого)0,2 мклпраймер 115 пмольпраймер 215 пмольДНК1 мклTaq полимераза0,3 мклН2Одо 25 мклПараметры ПЦР:предварительный прогрев 95С 5 мин,8430 циклов:95С 30 с,55С 30 с,72С 30 с,в конце программы 72С 10 мин.После проведения ПЦР в смесь добавляли 5 мкл 6х буфера для нанесения на агарозныйгель, проводили разделение фрагментов ДНК в 2% агарозном геле.855.
Выводы1.Теломеры термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha содержат на 3’-конце дополнительный dT нуклеотид, который не обнаруживается в составе внутреннихтеломерных повторов.2.Обратная транскрипция теломеразной каталитической субъединицей нуклеотидаА170 теломеразной РНК, в результате которой происходит добавление дополнительного dT,является фактором, ограничивающим длину теломер H. polymorpha.3.Белки Rap1, Tel1 и Mre11 не участвуют в контроле длины теломер H. polymorphaв отличие от их гомологов в дрожжах Saccharomyces сerevisiae.4.Делеция гена белка Rif1 приводит к увеличению длины теломер у H. polymorphaаналогично своему гомологу в S. сerevisiae.5.Белок Rif1 регулирует длину теломер H. polymorpha независимо от Rap1.6.Регуляция длины теломер H. polymorpha теломерными белками радикальноотличается от таковой в S.
сerevisiae.866. Список литературы[1] Shay J.W., Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. // Eur J Cancer. 1997. V.33. P. 787-791.[2] Damm K., Hemmann U., Garin-Chesa P., Hauel N., Kauffmann I., Priepke H., Niestroj C., DaiberC., Enenkel B., Guilliard B., Lauritsch I., Muller E., Pascolo E., Sauter G., Pantic M., MartensU.M., Wenz C., Lingner J., Kraut N., Rettig W.J., Schnapp A. A highly selective telomeraseinhibitor limiting human cancer cell proliferation. // EMBO J. 2001. V.
20. P. 6958-6968.[3] Wellinger R.J., Zakian V.A. Everything you ever wanted to know about Saccharomyces cerevisiaetelomeres: beginning to end. // Genetics. 2012. V. 191. P. 1073-1105.[4] Nandakumar J., Cech T.R. Finding the end: recruitment of telomerase to telomeres. // Nat Rev MolCell Biol. 2013. V. 14. P. 69-82.[5] de Lange T., Lundblad V., Blackburn E.H. Telomeres. // Cold Spring Harbor Laboratory Press;New York. 2006.[6] Hayflick L. Mortality and immortality at the cellular level.
A review. // Biochemistry (Mosc). 1997.V. 62. P. 1180-1190.[7] Shcherbakova D.M., Zvereva M.E., Shpanchenko O.V., Dontsova O.A. [Telomerase: structure andproperties of the enzyme, characteristics of the yeast telomerase]. // Mol Biol (Mosk). 2006. V.40. P.
580-594.[8] Greider C.W., Blackburn E.H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomeraserequired for telomere repeat synthesis. // Nature. 1989. V. 337. P. 331-337.[9] Sandell L.L., Zakian V.A. Loss of a yeast telomere: arrest, recovery, and chromosome loss. // Cell.1993. V. 75. P. 729-739.[10] Lue N.F. Plasticity of telomere maintenance mechanisms in yeast. // Trends Biochem Sci. 2010.V. 35. P. 8-17.[11] Ravin N.V., Eldarov M.A., Kadnikov V.V., Beletsky A.V., Schneider J., Mardanova E.S.,Smekalova E.M., Zvereva M.I., Dontsova O.A., Mardanov A.V., Skryabin K.G. Genomesequence and analysis of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha DL1.
// BMC Genomics.V. 14. P. 837.[12] McEachern M.J., Blackburn E.H. A conserved sequence motif within the exceptionally diversetelomeric sequences of budding yeasts. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1994. V. 91. P. 3453-3457.[13] Konig P., Giraldo R., Chapman L., Rhodes D.
The crystal structure of the DNA-binding domainof yeast RAP1 in complex with telomeric DNA. // Cell. 1996. V. 85. P. 125-136.[14] Moretti P., Freeman K., Coodly L., Shore D. Evidence that a complex of SIR proteins interactswith the silencer and telomere-binding protein RAP1. // Genes Dev.
1994. V. 8. P. 2257-2269.87[15] Wotton D., Shore D. A novel Rap1p-interacting factor, Rif2p, cooperates with Rif1p to regulatetelomere length in Saccharomyces cerevisiae. // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 748-760.[16] Hardy C.F., Sussel L., Shore D. A RAP1-interacting protein involved in transcriptional silencingand telomere length regulation. // Genes Dev. 1992. V. 6. P. 801-814.[17] Vodenicharov M.D., Laterreur N., Wellinger R.J. Telomere capping in non-dividing yeast cellsrequires Yku and Rap1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
